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Ⅱ型胶原C端肽单克隆抗体制备及鉴定
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基础实验诊断研究
Ⅱ型胶原C端肽单克隆抗体制备及鉴定
赵丹慧张励力蓝钒王娜袁越张砚卓
【摘要】目的 制备Ⅱ型胶原c端肽中EKGPDP多肽片段(谷氨酸一赖氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天
采用戊二
冬氨酸-脯氨酸)的单兑隆抗体(McAb),并进行抗体的纯化、鉴定及初步临床验证。方法
hole
醛法制备EKGPDP一钥孔嘁血蓝素(k。ylimpethemo。y舢n,KLH)抗原载体复合物。腹腔及静脉攻
击法免疫BALB/c小鼠8只:按常规方法将小鼠骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞融合。筛选阳l生克隆
株.以有限稀释法克隆3次。对杂交瘤细胞株的染色体、亲和力、类型和稳定性进行鉴定,取其中亲和
力较高的6株制备腹腔积液,用盐析及蛋白G琼脂糖凝胶珠层析法纯化抗体。对McAb的纯度、特异
性、交叉反应性及免疫活性进行鉴定。用免疫组化法对骨性关节炎膝关节软骨和椎间盘软骨样品进
行分析。,结果 本研究获得13株能高效分泌特异性McAb的杂交瘤细胞株;经5个月传代35代和
1×
8×104(EKG7)、5
反复冻存复苏6次,培养上清稳定性良好。6株McAb腹腔积液效价分别为2
l
103(EKGl4)、51×105(EKGl6)、51×】o’(EKGl8)、5x105(EKc25)、32×104(EKG28)。电泳结
果证明,盐析法纯化腹腔积液得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为8.07
mg、3.35
(A。。)、3.10(A。。),蛋白G亲和层析法得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为0.32
1119、1.83(A。,。)、o
66(A。,。),盐析法优于蛋白G亲和层析法(f=25.26,P0.01)。抗体的最佳应用浓
度为(50一150)¨∥L。临床初步鉴定发现,6株EKGPDP单克隆抗体在骨性关节炎及突出椎间盘软
骨标本中出现了不同程度的阳性结果。结论 本研究成功获得抗Ⅱ型胶原c端肽片段McAb,为Ⅱ
型胶原降解产物的测定提供了研究工具。
【关键词】胶原Ⅱ型;抗体,单克隆;标本制备
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