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紫外吸收法测定核酸含量
实验十二 紫外吸收法测定核酸含量 实 验 目 的 (1)掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理。 (2)掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法 原 理 DNA和RNA都有吸收紫外线的性质,最大吸收峰在260nm波长处。紫外吸收使嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质,所有含嘌呤和嘧啶的物质,都具有吸收紫外线的特性。核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用ε(P)表示。ε(P)为每升溶液中含有1mol核酸磷时的光密度(即吸光度或光吸收)。RNA的ε(P)为7700~7800,RNA中磷的质量分数约为9.5%,因此每毫升溶液中含1.0μg RNA的光密度为0.022~0.024。小牛胸腺DNA钠盐的ε(P)(260nm,pH7)为6600,含磷的质量分数为9.2%,因此每毫升溶液中含1.0μg DNA钠盐的光密度为0.020。 不同形式DNA紫外光密度不同,因为DNA具有双螺旋结构,当过量的酸、碱或加热使DNA变性时,则出现ε(P)260nm值升高的增色效应。在核苷酸量相同的情况下,ε(P)260nm有以下关系:单核苷酸单链DNA双链DNA。DNA变性后,双螺旋结构被破坏,碱基充分暴露,导致紫外光密度增加,还可根据DNA溶液在260nm处光密度的变化监测DNA变性情况。变性DNA复性后,ε(P)260nm值降低,称为减色效应。 蛋白质由于含有芳香氨基酸,也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在280nm,260nm处的光密度仅为核酸的1/10或更低,因此核酸样品只能够蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA在260nm与280nm处的光密度的比值在2.0以上,DNA在260nm与280nm处的光密度的比值为1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。紫外吸收法测定核酸含量简便快速,灵敏度高,一般可达3μg/ml的检测水平。 操 作 方 法 一、将样品配制成每毫升含550g的核酸溶液,与紫外分光光度计上测定260nm处的光密度值,按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值。 式中 OD260nm—260nm波长处的光密度值; L—比色杯的厚度,一般为1cm或0.5cm; 0.024—每毫升溶液内含1.0μg RNA的光密度值; 0.020—每毫升溶液内含1.0μg DNA钠盐的光密度值。 二、如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸,则在测定时需加钼酸铵—过氯酸沉淀剂,沉淀除去大分子核酸,测定上清液在260nm处的光密度作为对照。具体操作如下。 取两支小离心管,A管加入0.5ml样品和0.5ml蒸馏水,B管加入0.5ml样品和0.5ml钼酸铵—过氯酸沉淀剂,摇匀,在冰浴中放置30min,3000r/min离心10min,从A、B两管中分别吸取0.4ml上清液到两个50ml容量瓶内,定容至刻度。在紫外分光光度计上测定260nm处的光密度。 式中 ΔOD260nm--A管稀释液与B管稀释液在260nm波长处的光密度之差。 通常:1 OD=50ug/ml dsDNA 1 OD=40ug/ml ssRNA 1 OD=37ug/ml ssDNA * * *
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