SDSPAGE电泳试剂盒(细胞和组织).docVIP

SDS电泳试剂盒（细胞和组织） (产品编号DBI-1001; DBI-1002) I. 简介: 1） SDS电泳实验是绝大部分实验中很重要的一个环节，高纯度的起 始试剂是影响凝胶质量的一个重要因素，可靠的电泳结果取决于这一实 验的可重复性。该试剂盒中配备了进行SDS凝胶电泳实验所需 要的全部试剂，而且对试剂盒进行了优化组合，使实验者可以方便的进 行实验。聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以分离从50~500kDa 范围的蛋白质 分子。 II. 试剂盒内容: 试剂盒组分 DBI-1001 DBI-1002 颜色 10 次20 次 预混凝胶溶液（30%） 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 TEMED试剂 AP（过硫酸铵）试剂 1*Loading buffer(空白对照) 6* Loading buffer（样品使用） 蛋白标准（普通） 50ml 20ml 15ml 200ul*1支 0.06g*4支 200ul*1支 1ml*1支 3支 50ml*2 20ml*2 15ml*2 100ul*2支 0.06g*4支 200ul*2支 1ml*2支 6支 NM NM NM GRAY GRAY NM NM NM 备注：AP（过硫酸铵）试剂在使用前，每只管子中加入600ul的去离子水，溶 胶AP试剂，制成10%的溶液，于4度保存备用。10%的AP溶液可保存1—2 周。 试剂溶液通常储存在4。C，在混匀或灌胶之前无须恢复到室温。 III.蛋白质抽提步骤: 一、样品的准备 将所抽提好的蛋白质溶液，选用合适的蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。具 体内容可参考DBI 公司的Bradford 蛋白定量试剂盒（DBI—1045,1046） 和BCA 蛋白定量试剂盒（DBI—1047,1048）。 将抽提好的蛋白质溶液溶解于样品缓冲液中。取500ul的蛋白加入试剂盒 中所配备的6* Loading buffer（样品使用）100ul，混匀，于95度10分钟， 待样品冷却至室温即可使用。 二、分离胶浓度的选择 丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围 15% 15——45KD 12.5% 15——60KD 10% 18——75KD 7.5% 30——120KD 5% 60——212KD 实验者可以根据实验的蛋白质分子量大小选用不同的分离胶浓度进 行分离胶的配制和实验。 T%和C%是通常用来表示凝胶中丙烯酰胺组成的指标。T%是指丙烯 酰胺总的含量（w/v）， C%是指交联的丙烯酰胺（即双丙烯酰胺与丙 烯酰胺单体的比值（w/v）。有以下公式得出： T%=[丙烯酰胺（g）+双丙烯酰胺（g）/总体积（ml）]×100% C%=[双丙烯酰胺（g）/丙烯酰胺（g）+双丙烯酰胺（g）]×100% 三、试剂与缓冲液的准备 分离胶的配制（7.5ml） 浓度6% 7.5% 8% 9% 10% 12% 13% 15% 凝胶溶液（ml） 1.5 1.875 2 2.25 2.5 3 3.25 3.75 水（ml） 4.125 3.75 3.625 3.375 3.125 2.625 2.375 1.875 分离胶缓冲液（ml） 1.875 1.875 1.875 1.875 1.875 1.875 1.875 1.875 AP 试剂（ul） 100 100 100 100 100 100 100 100 TEMED 试剂（ul） 10 10 10 10 10 10 10 10 取一个10ml 的离心管（也可选用小型烧杯），根据上表选择的分离胶 浓度，依次加入凝胶溶液、水、分离胶缓冲液、AP 试剂、TEMED 试 剂，迅速混匀。（制成的分离胶溶液须在3 分钟内灌注到玻璃平板内） 浓缩胶的配制（5ml，3.9ml） 工作液的用量 灌制不同厚度的凝胶（两块6cm*8cm）所需的凝胶液量。 配制电泳缓冲液 取已配制好的5×电泳缓冲液150 毫升，加去离子水至750 毫升，备 用。 5×电泳缓冲液配方：总量为1L 15.1g Tris 碱（0.125mol/L） 72.0g 甘氨酸（0.96mol/L） 5.0g SDS(0.5%m/V) 准备蛋白质分子量标准品： 每个泳道加入5ul 纯化的蛋白质分子量标准便足够。 使用的设备 1、该试剂盒配备的试剂是根据BIO-RAD 公司的Mini—proteanIII 型 电泳仪来做配制的；其所配备的试剂和操作步骤也适用于其他公司 所需试剂试剂用量 凝胶溶液（ml） 0.65 水（ml） 3.05 浓缩胶缓冲液（ml） 1.25 AP 试剂（ul） 100 TEMED 试剂（ul） 10 凝胶厚度分离胶浓缩胶 0.5mm 5.6ml 1.4ml 0.75mm 8.4ml 2.1ml 1.0mm 11.2ml 2.8ml 1.5mm 16.8ml 4.2ml 的电泳系统。