SDSPAGE法测定Histag融合蛋白分子量产生偏差的原因.pdfVIP

唐威华 张景六王宗阳 洪孟民 (中国科学院上海植物生理研究所，上海200032) 摘要：}矗争懈／M．NTA系统是新发展起来的一个亲和 电荷的粒子，经电泳，由于聚丙烯酰胺凝胶的分子 纯化重组蛋白的有用工具，现常用于基因编码产物的 筛效应，不同大小的蛋白质分子向阳极移动有快慢 特性研究中。sDs_PAcE是实验室测定蛋白质分子量 的区别，因此可以由电泳后各蛋白的泳动距离推算 通常采用的方法，而许多实验室用此方法检测}lis-t躯 融合蛋白时却常发现测得的分子量偏大，产生偏差的 测定蛋白质分子量已是一种很成熟的实验手段，许 原因尚未阐明。为弄清这一问题，本实验室在研究一 个m}tag融合蛋白P73一His时，首先用sDs_PAcE法测 得其分子量确实比理论计算值大．然后对其进行c末 的检测，以初步判断表达的纯化产物是否预期的蛋 端氨基酸顺序测定、电喷雾质谱分析，结果证实其实际 分子量与理论值一致。酶切去除包括His—t鼯在内的 部分肽段使sDs_PAGE法测量蛋白分子量的偏差大大(Ham00d 降低，征实脚s-№#确实是造成偏差的原因之一。椎测 现象(Niu和Gu埘nan 由于}li争脚中的碱性氨基酸的作用造成蛋白在sDs_了这一问题(瞄m和ch埘g PAGE中迁移变慢，而导致偏差。这一现象值得引起 有关研究者的注意。 定，对造成偏差的原因也未进一步研究。 关键词：}lis—tag／Ni—NTA，融合蛋白．sDs_PAcE，电喷雾 系列新克隆到的水稻基因进行表达及产物纯化，因 质谱．分子量 此试图首先搞清这一偏差的产生原因。本文报告 学科分类号：074 近年来，在分子生物学或基因工程研究中，为 接上一段含有His．咄编码顺序的核苷酸后，在大 了便于得到被研究基因所编码的蛋白，往往将所研 究的基因转化到大肠杆菌细胞中，经诱导物作用使 蛋白的分子量时，的确观察到它比理论计算的分子 1994)。为j，使表达出的蛋白 之大量表达(H0cknev 便于分离纯化，通常还在基因的5’端或3’端连接 量偏大j，许多。但我们进一步对纯化的融合蛋白 上某些核苷酸顺序，使表达出的融合蛋白含有与某 的C末端氨基酸顺序进行了测定，并用电喷雾质 些树脂有亲和作用的肽段，从而可以用亲和层析的 谱分析证实该蛋白确系我们所要的目标蛋白，而且 方法很简便地将表达的蛋白纯化出来。His一脚r／Ⅳj—其实际分子量与理论计算值相符。这就证明了用 NTA系统就是这样一种方法，它将目标蛋白以与连 是正确的，其分子量并未发生改变，而是在采用 续6个组氨酸残基(His．t矩)融合的形式在大肠杆 菌中表达，利用His—tag与Ni离子的亲和作用，其 表达产物可以用Ni一ⅣrA树脂一步纯化(}khuli等 Hjs—l口是造成这一偏差的原因之一。 1987)。由于引入的His_t职分子量小，几乎不影响 蛋白原有的功能，而且纯化方便，这一系统现已为 1材料与方法 许多分子生物学研究者采用。但在实际工作中采 用这一系统时也会遇到一些问题，首先遇到的就是 1．1实验材料 融合蛋白分子量的检测问题。目前许多实验室测 1．1．1仪器 PE_ABI491Procise 定蛋白质分子量通常是用十二烷基硫酸钠一聚丙烯 c蛋白质序列仪，电喷雾质谱仪 酰胺凝胶电泳(sDs—PA