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不加三乙胺进行含氮化合物的色谱分离.docVIP

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不加三乙胺进行含氮化合物的色谱分离

不加三乙胺进行含氮化合物的色谱分离 上一篇 / 下一篇 2008-06-11 12:43:50 查看( 359 ) / 评论( 0 ) / 评分( 0 / 0 ) 引言   用反相HPLC 分离碱性化合物时,色谱峰的拖尾问题是大多数色谱工作者非常关注的问题。碱性和含氮化合物能形成能满足分离和定量要求的对称峰。由于许多生物活性化合物都含氮,因此给这些药物和植化成份的HPLC分析带来了困扰。   用反相HPLC分离碱性化合物时,色谱峰的拖尾问题是大多数色谱工作者非常关注的问题。碱性和含氮化合物能形成能满足分离和定量要求的对称峰。由于许多生物活性化合物都含氮,因此给这些药物和植化成份的HPLC分析带来了困扰。   有几种克服硅醇基相互作用所致峰拖尾的办法。常用的措施是降低流动相的pH值,一般pH值小于3 时硅醇基将不再引起峰拖尾。在pH 值小于3 时,硅胶基质上的硅醇基被质子化(硅醇基的pKa 约为3.5),从而使硅醇基与溶质的相互作用减少。但是,这样也可能改变了分离的选择性和分离度,因此也不一定是好的选择。   第二个措施是提高流动相的离子强度。通过增加流动相的缓冲容量,抑制碱性化合物与硅胶之间的相互作用。但是,当增加的缓冲液在仪器内外/在进行色谱分析时发生沉淀,特别是在泵密封垫上发生沉淀时,可能会带来其它问题。应注意根据缓冲范围使用适当的缓冲液。表1 列出了几种最常用的缓冲液。   另一个可能的解决办法是在流动相中添加三乙胺(TEA)。TEA作为一种竞争碱,减少了固定相硅醇基的可用性,也减少了分析物与硅醇基之间的相互作用。  一些色谱工作者不赞成在流动相中加入竞争性胺,因为这使流动相添加了额外成分,将给色谱柱造成不可恢复的改变。要从色谱柱上洗掉较强的胺,如TEA,非常困难。这一现象的一个例子就是,系统中使用TEA后,正离子模式电喷雾LC/MS一直有m/z 为102的离子,说明污染的不只是柱子,还有管路[1]。要除去TEA,需要用5% 到10% 的醋酸清洗系统。也就是说,被TEA修饰过的柱子不再适用于那些流动相中不含TEA 的应用。TEA 的作用是竞争性碱,让可能反应的硅醇基饱和,从而减少峰拖尾的可能性。对大多数分析来说,10 mM的TEA已经足够,但许多情况下可能使用得更多。而且,TEA的碱性很强,如果添加到没有缓冲或弱缓冲能力的流动相中,可能导致溶剂pH值急剧升高,可能会损坏色谱柱,进而影响分离,最终缩短柱寿命。最好的解决办法是使用对TEA需求最少的色谱柱。   Eclipse Plus 采用了专利的硅胶处理技术,改进了键合和封端工艺,不用添加TEA,靠色谱柱本身就能降低峰拖尾。 实验部分   所有分析都在Agilent 1200 上进行,系统包括一个自动进样器、二极管阵列检测器、二元泵、脱气机、柱温箱。法莫替丁、甲氰脒胍和哌仑西平样品购自Sigma Aldrich(St. Louis,MO,美国)。将这些样品溶解在50/50 MeCN 乙腈/水中。白毛茛样品在当地购买,按照参考文献2 中的步骤,用70/30/0.1% v/v/v 水/乙腈/磷酸提取,超声、离心,用提取溶剂稀释。黄藤素、黄连素和白毛莨碱标准购自Sigma Aldrich,用流动相配制。用这些标准品鉴定白毛茛提取物。 结果与讨论   图1 是Eclipse Plus C18 柱和另一种C18 柱上分离三种治溃疡药物:法莫替丁、甲氰脒胍和哌仑西平(添加TEA和不加TEA)的色谱图。这三种含氨基药物的结构见图2。甲氰脒胍和法莫替丁是组胺H2-受体拮抗剂,通过关闭产生胃肠液的通路治疗治溃疡。哌仑西平是一种M1-竞争性毒蕈碱受体拮抗剂,能抑制胃酸的产生。治溃疡药是最常用的药物。从图1 中可以看出,加入10 mM 的TEA后,三种分析物在C18 柱上的峰形得到了改善。加入TEA后哌仑西平峰的拖尾因子从没加TEA的1.74 变为1.02。但我们注意到,只要换成Eclipse Plus C18 柱,甲氰脒胍和哌仑西平的峰形和柱效都有了改善。实际上,这些峰的拖尾因子与使用了TEA的C18 非常接近,柱效更高。用Eclipse Plus C18 分析时,不需要任何流动相改性剂就能得到很好的峰形和柱效。  图3 显示了Eclipse Plus C18 柱在分析功能食品白毛茛中的应用。白毛茛一直用做抗菌、抗炎、减充血剂,用于治疗各种肠道紊乱,是使用最广泛的功能食品原料之一。采用一种通用的方法[2],评价Eclipse Plus C18和另一种C18柱,加TEA和不加TEA的分离效果。   在这个例子中,我们测定了500-mg 市售白毛茛根的提取物。白毛茛的两个主要成分是黄连素和白毛茛碱。方法中提到了黄藤素,但是在测定的植物Hydrastis Canadensis L(北

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