动物染色体标本的制备与观察.pptVIP

动物染色体标本的制备与观察 实验目的 实验原理 实验步骤 作业 实验目的 初步掌握动物骨髓细胞染色体标本制备基本过程,了解操作步骤的原理。 了解常用实验动物染色体的数目及特点。 实验原理 凡处于增殖状态的细胞,或者经过处理进入分裂的细胞即可用于染色体分析。在动物的各种组织中，骨髓是处于不断分离的组织之一，是用于动细胞遗传学研究的好材料。 进行染色体观察、分析，需要选择处于分裂中期的细胞。给动物注射一定量的秋水仙素即可使许多处于不同分裂期的细胞停滞于中期。 采用常规空气干燥法制备染色体标本,不需要经体外培养和无菌操作, 是一种简便方法。 I.小白鼠骨髓细胞染色体的制备方法 动物按4μg/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素,3-4h.后杀死动物。 取出动物后肢的胫骨和股骨,剪去两端。 将0.6-1ml2%柠檬酸钠用1ml注射器接上5#针头注入骨髓腔,将骨髓细胞先冲入小碟内,取下注射器针头,反复吸打骨髓细胞,使细胞团块分散,转入10ml离心管。 视骨髓量之多少加入0.4%KCL溶液8-10ml,随即将离心管置37±0.5℃水浴中低渗10min. 以1000r/min离心8 min。 弃上清液,沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇:冰醋酸(3:1)固定液5ml,加固定液时注意不要冲动细胞团块。 以1000r/min离心8 min。 I.小白鼠骨髓细胞染色体的制备方法 加完固定液后,立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀,静置固定20 min.入此反复固定2-3次,每次20 min。 固定的细胞经离心后,吸去上层固定液,视管底细胞多寡加入少量新配制的固定液,将细胞团块轻轻吸打成悬液。 在干净,湿,冷的载玻玻片上滴2-3滴上层细胞悬液,干燥。 将玻片标本平放于支架上,细胞面朝上,每片滴加1:10磷酸盐缓冲液3-4ml,染色10 min。 在自来水管下细流冲洗数秒,去掉磷酸盐缓冲液,用小块纱布擦干玻片标本底面和四周,显微镜观察和分析。 II. 蟾蜍(或蛙)骨髓细胞染色体的制备 动物按30μg/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素,7-8h.后杀死动物, 取后肢股骨和胫骨,剥掉全部肌肉,剪去股骨和胫骨两端。 将1 ml 1%柠檬酸钠溶液用1ml注射器通过5#针头注入骨髓腔,细胞冲入小碟内。 摘掉针头,用注射器轻轻反复吸打,使分散成单个细胞。 将骨髓细胞转入离心管,以1500r/min离心5 min，去上清。 视骨髓量之多寡加入事先预热至26±0.5℃的0.4%KCL溶液8ml,将沉淀吹散，置26±0.5℃水浴中低渗30min。 以1500r/min离心8 min。 II. 蟾蜍(或蛙)骨髓细胞染色体的制备 弃上清液,沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇:冰醋酸(3:1)固定液5ml,加固定液时注意不要冲动细胞团块。 加完固定液后,立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀,静置固定10 min，离心去上清夜。如此反复固定2次,每次10 min。 固定的细胞经离心后,吸去上层固定液,视管底细胞多寡加入少量新配制的固定液,将细胞团块轻轻吸打成悬液。 在干净,湿,冷的载玻玻片上滴2-3滴上层细胞悬液,在酒精灯上温火烘干。 将玻片标本放于染色缸中支架上, 染色10 min。 用蒸馏水洗数秒,去掉吉姆萨染液, 擦干玻片标本底面和四周,显微镜观察和分析。 微量全血培养 后染色体标本的制备 培养终止前6小时，加入秋水仙素，使终浓度为0.2mg/ml,例如，若秋水仙素的浓度为1/10000，则在5ml培养液中加入秋水仙1/100 ml，即用4号针头加入一滴。 由温箱中取出培养瓶，进行粗略检查后，打开瓶盖，用吸管将培养物移至离心管内，1000转/分离心5分钟，弃上清液。 加入0.075M KCL，室温低渗处理18分钟，离心，弃上清液。 加入新配制的固定液3 ml，加完后用吸管轻轻吹年打散细胞团块，固定10分钟，离心，弃上清液。 微量全血培养 后染色体标本的制备 重复固定一次。 视沉淀多少，加入适量固定液。滴一滴细胞悬液于干净、预冷、带有完整水膜的载玻片上，将玻片倾斜450或垂直插入玻片盒中，自然干燥。注意：玻片一定要无油脂，手指尽量捏在玻片的端部，同时，要在水膜褪去之前滴片。 染色：将已完全干燥的玻片浸入染液中染色5-10分钟。 注意：未完全干燥的玻片，因其尚有冰醋酸，将会影响染液的PH值，从而严重影响染色效果。 作业 绘制染色体图并作简要分析 观察细胞密度是否适中，细胞密度过大，不利于染色体分散，细胞过稀，则影响镜检速度，观察后，调整剩余悬液的浓度，继续滴片，滴后写明学号，不要染色，留至下次实验用。 是否有分裂细胞？分裂指数是多少？若无分裂细胞，是否可以就此断言细胞没有生长？为什么？ 若有分裂中期相，染色体形态如何？染色体弯曲或收缩过短，染色体数目不全或重叠的主要原因分别是什么？ 若