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实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 清洗试管24支 酸性磷酸酶： 催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。 是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。 酶液 磷酸苯二钠 苯酚 ＋ 磷酸氢二钠 folin-酚测定酚的浓度 计算出反应速度（用产物生成量/min来表示） 根据双倒数法计算出Km及Vmax 三、实验步骤： 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 3、制作酚标准曲线 4、[S]与V0关系实验 5、双倒数作图法计算Vmax和Km 生化实验课老师：于晓虹 实验报告请交到讲台上来 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释３０倍，用大试管装 科代表 李博恒 1、磷酸酶原液的制备： 称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。 上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实验。 加 液 程 序 表 管号 1 2 3 4 5 6 0 磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 精确反应时间 3 5 10 15 20 25 碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 酶液 － － － － － － 0.5 Folin－酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin－酚溶液已稀释好！ 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始 3、制作酚标准曲线 （目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟产物生成量来表示） 4、[S]与V0关系实验 实验中需注意事项： 酶反应作用时间精确控制 * 一、概述 二、实验原理 V= Vmax [S] [S] Km + buffer substrate enzyme Certain Time blank Stop the reaction Color developed 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 （目的：选取合适的反应时间） 35℃保温10分钟 吸光度 25 20 15 10 5 3 0 反应时间 6 5 4 3 2 1 0 结果： 以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围。 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin-phenol reagent 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1M Na2CO3 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 H2O 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.4mM phenol standard solution 8 7 6 5 4 3 2 1 0 加 液 程 序 表 35℃保温10分钟 吸光度 0.32 0.28 0.24 0.20 0.16 0.12 0.08 0.04
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