山大生化实验报告 实验十一 微量凯氏定氮法.docVIP

微量凯氏定氮法 姓名：周超 学号：201100140067 班级：11级生命基地 同组者：刘炳煜 时间：2011年6月4日 【实验目的】 1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。 2、学会使用凯氏定氮仪。 【实验原理】 凯氏定氮也称克氏定氮。样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。然后经强碱碱化使硫酸铵分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度，即可计算的样品之含氮量，若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3 （1） 2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4 （2） (NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3↑ （3） 反应（1）（2）在凯氏烧瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行（如图1），其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，及硫酸钾以提高溶液之沸点，收集氨可用硼酸溶液，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，然后用强酸滴定，所用无机酸的量即相当于被测样品中氨的量，本法适用范围约为0.2～1.0mg/mL氮。 凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。 图1 微量凯氏定氮蒸馏装置 【实验试剂】 实验仪器实验材料 浓硫酸 K2SO4·CuSO4混合物 双氧水 0.3mg N/ml的标准硫酸氨 硼酸 30%的NaOH溶液 0.0093mol/L的HCl溶液 甲基橙指示剂 蒸馏水 【实验步骤】 将凯氏定氮仪器的装置仪器安装好。 样品的消化：牛奶：水=1:1的样品2ml，加入4ml H2SO4，再加入200mg K2SO4?CuSO4 催化剂，加热，消化至消化液由褐色变淡直至淡黄色，冷却，加入双氧水数滴，继续加热至消化液至浅蓝色，冷却定容至100ml，备用。 空白的制备：样品部分换成水，其他的操作与操作2相同。 仪器的洗涤：在蒸气发生器内加入5mL浓硫酸和2滴甲基橙，并加蒸馏水总量加至容器容积的2/3,接收瓶内加入5mL混合指示剂，加热；如果接收瓶内指示剂不变色则表明洗净，关闭电炉，在小漏斗内加入蒸馏水，打开止水夹，将水放入，将废液倒吸出。 标准硫酸氮含量测定： 接收瓶内加入5mL硼酸，反应室内加入1ml（NH4）2SO4（样品测定时，加入2ml样品），10ml 30%NaOH溶液，加热；待混合指示剂变为淡绿色时计时3min，然后使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量去离子水洗涤冷凝管口，继续蒸馏1min。然后用标准盐酸进行滴定，平行测定三次。 样品的测定：相同的方法测定，空白测二组，样品平行测三次。 【实验结果】 (一)实验数据 1、标准硫酸铵含量测定 组数 消耗标准盐酸量（0.0093mol/L）/ml 第一组 2.52 第二组 2.44 第三组 2.48 平均值 2.48 2、样品含量测定 组数 消耗标准盐酸量（0.0093mol/L）/ml 第一组 1.62 第二组 1.66 第三组 1.62 平均值 1.63 空白滴定均为0 （二）数据处理 1、标准硫酸铵含量测定计算 消耗盐酸的平均体积为2.48ml 标准盐酸的浓度为0.0093mol/L 氮含量=2.48×10-3 ×0.0093×14×1000=0.323mg/ml 2、样品含量计算 消耗盐酸的平均体积为1.63ml 标准盐酸的浓度为0.0093mol/L 氮含量=1.63×10-3 ×0.0093×14/2×50×100=0.530g/100ml 蛋白质含量=0.530×6.25=3.313g/100ml 【思考讨论】 结果分析 本次实验结果比实际值（2.9g/100ml）偏大，原因可能是 滴定操作导致的误差，在用标准硫酸铵进行滴定练习时，计算的含量比正常值大，因此可能是滴定不规范造成盐酸过量，导致误差。 可能是盐酸长期暴露在空气中挥发，导致其实际浓度比原标定浓度偏小，最终导致滴定的盐酸体积大于实际的，最终导致蛋白含量偏高。 微量凯氏定氮法测得的氮不全是蛋白质中的氮，也可能是牛奶包含的其他物质中的氮，因此导致蛋白质含量偏高。 本实验是根据含氮量间接求出蛋白质的含量，是根据蛋白质的平均含氮比值计算的，并不是本实验样品中蛋白质的准确含氮量。 蒸气发生瓶里的液体酸度不够，在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大 注意事项 定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。蒸馏时需控制火力以避免样液倒吸。消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控