腹水的制备.docVIP

这里还有一个获得腹水经验性步骤，不知道能否帮的了你1 选用雌性Balb/c小鼠，小鼠一定要健康。2 腹腔注射0.5ml石蜡油/鼠，1-2周后（我一般选用注射10天后的小鼠，不过注射3-4周后的小鼠仍可用）腹腔注射细胞。3 打腹水时，细胞要处于对数生长期，细胞数量过多过少都不好，我一般是注射10^6/鼠，每株杂交瘤打3只。4 约7天后，触摸小鼠腹部有肿胀感时，即可用16号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心。我每次 可采集4-5ml腹水/鼠，有时甚至可达6ml，隔天后再次采集，一般可采集三次左右，每只小鼠可采集十多ml腹水。有时一只小鼠采到20多ml腹水后仍 然活得很好（这也很烦）。还有一点，采集用的针头要事先灭菌！2-3次。我做过2种类别10株细胞的腹水，以下供参考： 1、每组细胞准备2只小鼠，8-10周龄，最好与制备单抗的小鼠同系；接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂，可以用石蜡油（提前一周）或不完全弗氏佐剂（提前三天）； 2、第一只接种细胞数可以控制在10的6次方，如果出现腹水少、死得快的现象，则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*10的5次方；注射细胞少腹水形成慢但效价会更高； 3、待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况，如果活力佳，有明显移动性腹水，可以放腹水2次左右；一旦发现小鼠活动受限，要立即处死放腹水； 4、一般每次可以收取2-3ml。 制备小鼠腹水细节 剪刀剃毛，酒精消毒 止血钳、镊子夹提腹部皮毛 小号针头，越细越好，减少损伤 eppendorf管或玻璃试管装均可，但要高压灭菌 刺入针头时注意先提起腹部皮毛，在腹部中线旁刺入空隙，勿扎住内脏 腹水采集分成两类： 1：活着是 抽取腹水 2: 处死抽取腹水 活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器（2-5ml） 以及灭后菌的eppendorf管 因为腹水还要分离所以用这个最好，便于离心）。方法就是用酒精棉球擦拭要进针的位置（大概是在腹部中线偏右侧处）， 而后先让注射器中留点空气而后进针再将注射器慢慢往后推腹腔中有压力慢慢腹水会往外流，进针时要轻轻下上提一下，感觉无阻碍就好。 处死抽取腹水就是用止血钳两把，剪刀小号2把，镊子2把即可。 先用剪刀镊子轻轻在小鼠腹腔外皮剪一个小口，而后用两把止血钳轻轻两边拉开，使露出腹部，而后用另一把剪刀镊子剪开内皮，用枪或玻璃直管即可去腹水。也建议放置eppendorf中。 操作步骤?操作时间?操作内容?1，小鼠致敏?7-20天（1-3周）?取6-8周龄Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷（Pristane），0.5ml/每只，注射后7-20天左右开始注射杂交瘤细胞?2. 杂交瘤细胞腹水制备?7天（1周）?收集培养好的杂交瘤细胞，并用培养液清洗，取107细胞注射于小鼠腹腔，约7天后可见小鼠腹腔肿大?3. 腹水收集与保存?1-15天（可多次收集，直至小鼠自然死亡）?采用无菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，这样多次反复采集直到老鼠自然死亡。采集到的腹水分装归类最后于负七十度冰箱保存。?腹水的制备过程比较简单： 第一步，提前一周用弗氏不完全佐剂0.5ml注射小鼠腹腔；第二步，注射佐剂后一周将生长旺盛的杂交瘤细胞离心弃去培养基，用PBS或者不完全培养基重悬后注射小鼠腹腔，一般7-10天左右就可以看到小鼠腹腔明显肿大，此时可以处死小鼠采集腹水，也可以用注射器反复隔日抽采腹水。反复抽采的方法得到的腹水产量比一次性处死得到的腹水产量高。除了腹腔注射杂交瘤，还可以脾内注射，其方法有点类似脾脏内免疫。具体操作是：提前一周注射弗氏不完全佐剂，注射后一周左右用乙醚麻醉小鼠，剪开背部皮肤，可以看到脾脏，用注射器刺穿背部皮肤，将杂交瘤细胞注射到脾脏里，再用AB胶将伤口处的毛粘好，涂上抗生素即可，7-10天后可见腹水形成。这种方法的优点是对杂交瘤细胞的数量要求少，一般1000个以上的细胞都可以成功制备腹水。刚采出的腹水含有大量的油脂、巨噬细胞、杂交瘤细胞、腹腔内的上皮细胞、血液中的细胞成份等杂质，尤其是这些细胞成份，如果不除去则可能在腹水的长期保存中慢慢破裂，细胞内的蛋白质成份会释放到腹水中，增加了腹水中的杂质，使纯化变得困难，因此腹水在采集后不管是要长期保存还是立即纯化都应该先离心除去细胞的成份，同时也去掉油脂（油脂的密度比较小，一般都漂浮在腹水表面，用枪吸出丢掉即可）。 三、单克隆抗体的生产获得稳定的杂交瘤细胞系后，即可根据需要大量生产单抗，以用于不同目的。1、单抗的大规模制备目前大量制备单抗的方法主要有两大系统，一是动物体内生产法，这是国内外实验室所广泛采用；另一是体外培养法。（1）??动物体内生产单抗的方法迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多