蛋白质分离纯化鉴定 .pdfVIP

一，蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质 则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化 蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常 用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋 白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度 随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面， 温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采 用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解 酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电 点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可 解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质 用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质 部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等 中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳 酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于 水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一 定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下 操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为 丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围 内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH 及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高， 蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程 度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐 离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层， 使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等 电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的 盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段 沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操 作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如 血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更 容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。 （3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地 一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白 质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸 钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱 和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在 这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果 也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当 用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析， 即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断 的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄 糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋 白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀， 但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。