蛋白质组学研究中的核心技术—双向凝胶电泳 .docVIP

蛋白质组学研究中的核心技术—双向凝胶电泳 人类基因组计划与美国塞莱拉遗传信息公司于 2001 年在美国《科学》杂志和英国《自然》杂志联合宣布，他们绘制出了准确、清晰、完整的人类基因组图谱，至此，人类基因组计划已基本完成，随着后基因组时代的到来，蛋白质组学得到了空前的发展，蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。包括蛋白质组、蛋白质组学、功能蛋白质组学和结构基因组学等新的概念的提出，蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃的学科。其中双向电泳 (Two Dimensional Electrophoresis ， 2DE) 是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一 ( 另两种是质谱技术和蛋白质组信息学 ) 。由于双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置，它可用于蛋白质转录及转录后修饰研究，蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用，细胞分化凋亡研究，致病机制及耐药机制的研究，疗效监测，新药开发，癌症研究，蛋白纯度检查，小量蛋白纯化，新替代疫苗的研制等许多方面。 　　双向电泳由于具有高分辨率和高灵敏度已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。自 1975 年， O Farrel 等建立这种技术后，已有许多改进，使得这一技术日趋完善， 2DE 的第一向电泳是等电聚焦电泳 (Iso-Electric Focusing ， IEF) ，然后通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS) 对蛋白质进行第二向电泳；在 IEF 中，蛋白质因等电点不同而被分离，在 SDS中，不同分子量的蛋白质相互间被分离开，再用考马斯亮兰或银染进行检测，经 Pdquest 等软件对结果进行比对、解析。由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重要性质，而 2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差异分离蛋白质，因此 2DE 的分离能力非常强大，它甚至能将细胞中的 5000 种蛋白分离开， 2DE 在分离蛋白混合样品，比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查明大型蛋白复合物各组组分，与其它生物技术如分子生物学、分子遗传工程、免疫学、微量蛋白质的自动氨基酸序列分析相结合，可以快速准确地发现和鉴定新的蛋白质 1. 双向电泳技术应用过程中的关键步骤 a. 样品制备 ( 蛋白提取 ) (1) 细胞培养、处理和收集； (2) 将细胞在 IEF 裂解缓冲液中溶解； (3) 将样品离心以去除不溶的细胞碎片和 DNA ，提取上清， -80 ℃保存。 b. 蛋白质定量和上样 (1) 固相 PH 梯度干胶条 (Immobi-line PH Gradient ， IPG) 水化、等电聚焦； (2)IPG 的平衡； (3)SDS； (4) 蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色。 c. 图像分析及数据处理 　　将染色后的凝胶放在 GS-710 光密度扫描仪上，扫描后的图像用 PDQUEST 2D 软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行比较。 2. IPG 的优点 a.PH 梯度稳定、聚焦准确、精度高； b. 无阴极漂移、碱性蛋白丢失的现象； c. 蛋白上样量大，可提高低含量成分的分辨效果； d. 样品中的盐的干扰少，无边缘效应； e.PH 梯度、分离结果重现性好。 3. 在双向电泳应用中所面临的问题 　　许多疏水性蛋白质 ( 如膜蛋白 ) 不溶于样品缓冲液，分子量过大 (200kD ( 千道尔顿 )) 极端酸性或碱性蛋白在电泳过程中易丢失， 2DE 不能分辨。低含量组分易被高含量组分遮蔽，降低分辨率。蛋白在提取和消化过程中的丢失、凝胶的污染、在不影响分辨率情况下的上样量等等。 4. 双向电泳在医学研究中的应用 a. 人类疾病的蛋白质组研究 (1) 直肠癌：直肠癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活，癌基因活化的过程。 Sanchez 等对 15 例结肠癌和 13 例正常人的结肠上皮进行 2DE ，结果发现在分子量为 13kD 和 PI( 增殖指数 ) 值为 5.6 处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。其中 15 例患者的癌细胞中有 13 例 13kD/PI5.6 蛋白有上调趋势 (87%) 。此外，发现此种蛋白不仅在中度、低度分化的结肠癌及有 24 年病史的溃疡性结肠炎过度表达，而且出现在 7 例分化程度不同的腺瘤的癌前病灶，但对照组则很少出现，这表明该蛋白的出现对检测早期直肠癌有重要的临床意义。 (2) 肝癌： Peter 等在用 N- 甲基 -N- 亚硝基脲诱导的小鼠肝癌中，用 2DE 及氨基酸微型测序可分辨出肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质 (35kD/PI7.4) ，此种蛋白质在肝癌、胎肝中有高表达。经免疫组化证实，肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质在成人肝脏中不表达，但在小鼠的肝癌中又重新表达，同