实验一蛋白质定量测定.ppt

绪　论 2 通过生物化学实验应该做到 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。 3 实验记录与实验报告 3.1 实验记录 实验前做好实验预习。 实验中应及时准确地记录(事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。 3 实验记录与实验报告 3.2 实验报告 实验报告的格式应为： ⑴ 实验目的； 　　⑵ 实验原理； 　　⑶ 仪器、材料和试剂； 　　⑷ 实验步骤； 　　⑸ 结果讨论（含数理据处）； 　　⑹ 注意事项; (7)思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。 实验二 SDS(聚丙烯酰胺)凝胶电泳分离蛋白质 实验器材 垂直板电泳装置 电泳仪 支胶架 移液枪 移液管 烧杯 培养皿 电炉 六、思考题 该实验中如何去除蛋白质间电荷效应的？ 在不连续体系SDS中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 四、实验步骤 1.安装膜具 1）将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 将凡士林均匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃板封好。2）称取2g琼脂糖加100ml蒸馏水，慢慢的煮开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的(无气泡)琼脂糖倒入支胶架三分之二高度，快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中，注意凹槽朝外，用夹子固定好，待凝固后灌胶。2.制备SDS聚丙烯酰胺凝胶 1）制备分离胶 30%丙烯酰胺 5ml + 分离胶缓冲液 5ml +10%SDS 0.2ml +10%过硫酸铵 0.2ml + 蒸馏水 9.6 ml;混匀后加入8ulTEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿3cm处，立即在胶面上用移液管加入1-2cm的蒸馏水，静止，待凝胶聚合后（约30min），去除水相，然后用吸水纸吸干残余的水。2）制备浓缩胶 30%丙烯酰胺 1.32ml + 浓缩胶缓冲液 1ml +10%SDS 0.08ml +10%过硫酸铵 0.08ml + 蒸馏水 5.6 ml;混匀后加入8ulTEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入垂直板至离槽沿0.5cm处，插入梳子（不能混入起泡），静止，待凝胶聚合后，加入电泳缓冲液，拔去梳子。 3）先用刀片将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子上取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝内），将电泳缓冲液倒入电泳槽内。3.样品预处理 取0.5ml样品加入0.5ml上样缓冲液，置沸水中煮5分钟。4.上样 1）第一个孔内加20ul标准蛋白质溶液2）其他每孔加入20ul样品。上样时要将移液枪头垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品5.电泳 接通电源，将电压调至80V、50mA。当溴酚兰进入分离胶后，把电压提高到150V、80mA，电泳至溴酚兰距离胶底部1-2cm处，停止电泳6.固定 取下凝胶，置于培养皿中的固定液中，轻轻振摇10分钟，倒去固定液7.染色脱色 培养皿中倒入50-60度预热的染色液浸没凝胶，约40分钟后回收染色液，用清水冲洗掉胶上多余的染色液。倒入脱色液，防止2小时，期间换脱色液2-3次 图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 五、实验结果分析 94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 胶槽1 2 3 注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白 * * 生物化学实验Biochemical Experiment 1　实验目的 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法； 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能； 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。 4 实验成绩评分方法 平时成绩（20%） 实验报告情况（30%） 实验考试成绩（60%=理论30%+操作20%） 实验一 蛋白质定量测定 常