CTAB法提植物DNA原理及方法.pdfVIP

CTAB法提植物DNA 基因组DNA- CTAB 法 CTAB 法原理(植物DNA 提取经典方法) CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳 离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性. 在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是 不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可 使核酸分离出来. 注:CTAB 溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃. 基因组DNA- CTAB 法 CTAB 提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; EDTA 螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase 活性; NaCl 提供一个高盐环境,使DNP 充分溶解,存在于液相中; CTAB 溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离; β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除 基因组DNA- CTAB 法 CTAB 提取缓冲液的改进配方 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除 多酚,减少DNA 中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖. 基因组DNA 的提取核酸分离,纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA 时,应提供相应 的缓冲体系采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔离心分离两相时,应 保证一定的转速和时间针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方 法基因组DNA 的提取核酸分离,纯化 蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS,异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处 理核酸分离,纯化 多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2 体积的5M NaCl,高盐可 溶解多糖.用多糖水解酶将多糖降解.在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2 体积),氯 苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 .用PEG8000 代替乙醇沉淀DNA:在500 μL DNA 液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ,冰浴20min.核酸分离,纯化 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇,抗坏血酸,半胱氨酸, 二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它 们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA 的结合 盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸, 其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA 的目的另一种方式加入1/10 体积的 NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA 吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗 涤,以除去盐离子等若长期储存建议使用TE 缓冲液溶解TE 中的EDTA 能螯合Mg2+ 或Mn2+离子,抑制DNasepH 值为8.0,可防止DNA 发生酸解 。 基因组DNA 提取常见问题 DNA 中含有蛋白,多糖,多酚类杂质DNA 在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反 应DNA 中残留有金属离子有RNA 的存留原因对策重新纯化DNA,过吸附柱去除蛋白, 多糖,多酚等杂质重新沉淀DNA,让酒精充分挥发增加70%乙醇洗涤的次数(2-3 次)加 入RNase 降解RNA 问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR 反应.DNA提取常见问题材料不新鲜或反 复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈,DNA 被机械打断外源 核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆 组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA 时,可 增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水 配制,耗材经高温灭菌将DNA 分装保存于缓冲液中,避免反复冻融 问题二:DNA 降解.DNA 提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或 沉淀不完全洗涤时DNA 丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料动植物要匀浆研磨充分;G+ 菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁.高温裂解时,时间适当延长(对于动物细 胞,细菌可增加PK 的用量).增加吸附的时间,或低温沉淀小心操作 问题三:DNA 提取量少. 幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段，核较大而胞质较少，核酸浓度高，且内含物少、次生 代谢产物少，蛋白质及多糖类物质相对较少，在SDS 或 CTAB 物质存在时，经机械研磨， 使细胞破裂并释放出内含