DNA与RNA提取方法.docVIP

实验三 Trizol法提取细菌总RNA 一、实验原理 Trizol主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(107)均有较好的分离效果。Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。 主要试剂和器材 Trizol 溶液 氯仿 异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC水 超净工作台 2.0 mL离心管无Rnase 移液枪 紫外分光光度计 石英比色皿 泳槽和模具 电泳仪 凝胶成像系统 大肠杆菌 实验步骤  一. 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA 挑取大肠杆菌菌单菌落培养至稳定期取菌液 2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体 2、 每管加入 1 mL Trizol 溶液盖紧管盖激烈振荡15 s室温静置5 min 4℃12000 g离心 10 min取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L离心管中 每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol)盖紧盖剧烈振荡 15 s室温静置 3 min4℃, 12000 g, 离心10 min，小心吸取上层水相转入另一新的2.0mL 离心管，测量其体积,加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。 加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡15 s，室温静置 3 min，4℃12000 g离心 10 min小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管。 加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)轻轻颠倒混匀，室温静置 10 min，4℃12000 g离心 10 min，RNA 沉于管底，小心吸去上清 6、加1 mL75%的乙醇(预冷),并轻柔颠倒，洗涤沉淀4℃7500 g离心 5 min,小心弃上清，微离吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min。 各管用 30μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育5 min，分装，-80℃贮存(可贮存5周)。  二. RNA 浓度的测定 取 10 μL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照。在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值。根据公式计算 RNA 的浓度。 RNA 浓度(μg/μL)= OD260 × 稀释倍数(200)× 40(μg/mL)/1000 纯 RNA 样品的 OD260/OD280 比值为 1.8~2.0若低于该值，表明存在蛋白质污染，可重新用酚∕氯仿抽提。该值为 2.0 时RNA 纯度为最高。  三. RNA 质量检测 将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测 23 S 和 16S 条带的完整性和它们的比值。一般认为如果 23 S和16 S 条带明亮、边缘清晰并且23 S的亮度在 16 S 条带的两倍以上则 RNA的质量较好。 (1) 将洗净、干燥的电泳槽和模具水平放置在工作台上 准确称取 0.15 g琼脂糖加入 15 mL 1 × TAE 中,摇匀,在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解(中火档 2 min),待冷却至60℃时,加入 EB(终浓度为 μL/mL),充分混匀。 (3) 插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为 3~5 mm，置于室温下凝固。 (4) 待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液使液面高出凝胶 1~2 mm。 (5) 用微量移液器将样品8μL与上样缓冲液2μL混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的 DNA 分子量标准作为对照2000bp。 (6) 盖上电泳槽盖调节电压 100 V电泳 15min 左右。 (7) 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果用凝胶成像系统照相保存。 四、注意事项 1. RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。EP管及Tip头都要用0.1%处理(0.1% DEPC浸泡过夜后高压蒸气灭菌)。用于RNA实验的试剂须使用DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。最好在超净台内操作。 2、提取时操作带一次性手套、口罩等