可溶性糖测量方法.docVIP

实验 12 植物组织中可溶性糖含量的测定 ? 在作物的碳素营养中，作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为 NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。 Ⅰ 蒽酮法测定可溶性糖 一、原理 糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。 ? ? ? ? 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物鲜样或干样。 （二）试剂 1. 80 ％乙醇。 2. 葡萄糖标准溶液（ 100 μg/mL ）：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。 3 ．蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 ～ 3 周。 （三） 仪器设备 分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、 0.5 mL ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。 三、实验步骤 1. 样品中可溶性糖的提取 称取剪碎混匀的新鲜样品 0.5 ～ 1.0 g （或干样粉末 5 ～ 100 mg ），放入大试管中，加入 15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸 20 min ，取出冷却，过滤入 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。 2. 标准曲线制作 取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。 ? 表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量 试 剂 管 号 0 1 2 3 4 5 100 μg/mL 葡萄糖溶液（ mL ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ mL ） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蒽酮试剂（ mL ） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 葡萄糖量（ μg ） 0 20 40 60 80 100 ? 将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ）为横坐标绘制标准曲线。 3 ．样品测定 取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。 四、结果计算 式中： C ——从标准曲线查得葡萄糖量， μg 。 V T ——样品提取液总体积 , mL 。 V 1 ——显色时取样品液量， mL 。 W ——样品重（ g ）。 ? Ⅱ 苯酚法测定可溶性糖 一、原理 植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在 10 ～ 100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在 485 nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定 160 min 以上。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）