093800251李菁《端粒酶逆转录酶活性的调节机制》.ppt

端粒酶逆转录酶活性的调节机制与抗肿瘤药物的筛选 端粒重复扩增法(telomeric repeat amplificatlon protocol，简称TRAP) 什么是端粒酶？ 端粒酶(telomerase)是一种细胞RNA 依赖的 DNA聚合酶，其功能是维持真核细胞染色体末端端 粒的长度。由高度重复的TTAGGG序列构成的端 粒，具有保护染色体末端被降解以及和其他染色体连 接的作用。 端粒酶的组成？ 具有酶活性的端粒酶主要由两部分组成： RNA组分(hTR)含有与端粒酶重复序列结合的模板区 具有逆转录酶活性的蛋白催化亚基(hTERT) hTR亚单位在大多数组织细胞中表达，而hTERT常常只在增殖的细胞中表达。端粒酶的活性与hTR mRNA的表达水平无关，但在肿瘤中端粒酶的活性与hTERT mRNA水平密切相关。因此，hTERT的表达是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤。 转染hTERT可改变核基质与端粒的结合，产生基因调节信号，下调细胞衰老相关基因的表达，上调DNA修复相关基因活性，增加端粒的稳定性，减低染色体自发伤。 端粒酶调节的主要机制（hTERT的转录调节） hTERT mRNA与端粒酶活性存在良好的相关性，提示hTERT的表达是通过转录比率的变化来调节的，这种方式被认为是端粒酶调节的主要机制。 两者并非总是呈正相关。 经研究，在体内发现高水平的hTERT启动子活性伴低拷贝数的hTERT mRNA，进一步发现了4个参与hTERT基因调节的重要区域。 第一区域从翻译起始位(+1)～(一300)，为核心启动子，具有双向活性。有多个E盒和Spl结合位点。c—Myc和Max蛋白形成异二聚体后与，E盒结合活化hTERT 的转录。Mad蛋白是c-Myc的拮抗剂，可将Myc／Max结合转变成Mad／Max结合，从而降低hTERT 启动子活性。Spl也是通过与核心启动子中富含GC的位点结合而活化hTERT 的转录。Spl和c-Myc的共同作用可完全活化hTERT启动子，这些重要转录因子的上调，可能与癌变过程中端粒酶的活化有关。有人推测在正常细胞中存在端粒酶抑制物，在肿瘤中其功能和表达丧失，导致端粒酶再活化。此区有hTERT 的负调节剂wilms 肿瘤抑制基因产物 (wilms tumor supressor gene product，Wt 1)的结合位点。 第二区从(-1821~- 81lbp)，功能上涉hTERT第一个内含子的剪切，对hTERT的特异剪切起关键作用。 第三区从(-800~-300bp)为抑制区，含有hTERT的负调节剂骨髓特异性锌指蛋白2(myeloid-specific zinc finger protein 2，MZF-2)的结合位点 ，能降低hTERT的转录活性。 第四区位于结构基因外显子1的起始位置(+1~+1077)bp(含外显子2的大部分)。在抑制hTERT启动子活性中发挥主要作用。 hTERT转录后剪切 现已发现有6种不同的hTERT的剪切变异体。α、β为缺失型，另4个有内含子插入。这些变异体均无催化活性。在人类生长过程中，hTERT的剪切具有组织特异性屡特定成人组织中的激素应答性。 这表明hTERT的剪切不是随机的。 a变异体是主要的端粒酶活性抑制剂，通过精细地调节a变异体和全长的转录体之间的比例平衡来调节端粒酶的活性。 转录后修饰 hTERT转录后可在其特定的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基处磷酸化。研究发现，尽管未受刺激的淋巴细胞没有端粒酶活性，但有可检测的蛋白水平。受刺激后hTERT 蛋白量仅轻度增加，但hTERT蛋白磷酸化比例及活性大大增加，在细胞中的分布发生变化。 推测hTERT蛋白在未受刺激的细胞中以无活性的去磷酸化状态存在于细胞浆中，受刺激后磷酸化，并使其转移至细胞核中装配成有活性的端粒酶，在端粒处发挥功能。现认为转录后hTERT经PKC、ERK1／2和Akt激酶的磷酸化后，通过PKC依赖的信号转导途径，增加c—Myc的表达而活化端粒酶 。其调节与hTERT蛋白水平无关。 如果用蛋白磷酸化酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)去磷酸化，则端粒酶活性明显降低，提示去磷酸化可使端粒酶变成无活性的构象。对端粒酶修饰后其功能改变的进一步研究，有利于研制针对这一过程的特异的抑制剂，开发新的抗肿瘤药物。 伴侣蛋白介导的调节 hTERT与蛋白结合对其在细胞核的装配及活化是必须的。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)伴侣复合物包括HSP90、HSP70、P23，与hTERT功能相关。HSP90的靶标多是信号蛋白，它可使不稳定的信号传导蛋白保持构象改变而维持其活性 。加入HSP伴侣复合物的纯化成分，有助于hTERT蛋白的