口虾蛄高血糖激素基因全长cDNA序列的克隆及其表达分析.pdf

Molecular cloning and expression of a full length cDNA encoding crustacean hyperglycemic hormone (CHH) in Oratosquilla oratoria Zhang Xiuqin A Thesis Submitted to Dalian Ocean University In Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master Supervisor : Liu Haiying Commenced in : June, 2014 Completed in : June, 20 14 摘要 摘要 高血糖激素(crustacean hyperglycemic homone ，CHH) 对甲壳动物的生长发育生殖等生理生化过程 具有重要作用，参与调控甲壳动物血糖调节、生长蜕皮和性腺发育等多种重要的生理活动，能够显著提 高血淋巴中的葡萄糖的浓度，调节甲壳动物的糖类代谢，在发育阶段表现的尤为明显。甲壳动物眼柄组 织中高血糖激素含量最为丰富且被研究最多，也一直是国内外研究的热点。 口虾蛄(Oratosquilla oratoria) 是我国沿海重要的多年生的海产经济甲壳类之一，具有极高的经济价 值的优良野生品种。近年来，人们对口虾蛄的开发力度不断增大，加之过度捕捞，其野生资源已出现衰 竭的倾向，因此资源保护与增值是目前亟待解决的问题。关于国外虾蛄的研究报导越来越多，但主要集 中在遗传多样性、形态发育、生态学、组织学、养殖、繁育等方面，而口虾蛄的功能基因及表达分析方 面的研究报道仅此一篇。有哪些信誉好的足球投注网站CHH 神经肽，发现CHH 在甲壳动物中的进化关系至今尚不清楚，CHH 在甲壳纲十足目类群已经开展了大量的研究工作，而口足目的尚未有相关的研究报道。因此，有必要对 口足目以外的虾蟹CHH 基因特性进行研究，为探甲壳动物生长、繁殖相关基因的功能演化及进化关系 提供重要依据。本文以口虾蛄为实验材料，采用cDNA 末端快速扩增（RACE ）方法克隆CHH 基因全 长 cDNA 序列，并对口虾蛄不同组织做实时荧光定量分析，旨在为口虾蛄蜕皮等相关功能研究和作用 机制奠定基础，同时为其他甲壳类动物CHH 家族基因的功能研究提及进化机制提供参考。 本实验以口虾蛄眼柄为材料提取总 RNA ，首次通过 RACE 方法获得高血糖激素(CHH)基因全长 cDNA 序列。CHH 基因全长2421bp ，5’UTR 长度为180bp ，3’UTR 为1821bp，开放阅读框(ORF)长420bp， 编码 139 个氨基酸。预测蛋白二级结构α–螺旋23.74% ，延伸链占23.02%，无规则卷曲占53.24%，预 测分子量为15.47kD ，等电点(pI )为7.049 。CHH 成熟肽包含6 个CHH 家族中位置保守的Cys 残基，C 端为GK，推断为ES 型CHH 基因。聚类分析表明：口虾蛄CHH 和十足目CHH 聚为同一个分支的两 亚群，具有较近的亲缘关系，而后与十足目的MIH 和GIH 形成一分支。采用荧光定量PCR 技术首次 检测口虾蛄不同组织中CHH 基因的表达量，CHH 基因在血淋巴中表含量最高，在肠、眼柄、触角中有 较高的表达量，在肌肉和卵巢中表达量相对较低，而在精巢中不表达。研究结果为进一步口虾蛄CHH 多肽相关功能性研究和作用机制奠定基础，同时也为其他甲壳类动物CHH 基因的研究及系统演化和分 类系统提供借鉴。 关键词：口虾蛄；高血糖激素CHH ；分子克隆；荧光定量PCR ；表达分析 I Abstract