家蚕肠道细菌群体调查和分析.pdfVIP

维普资讯 46卷 2期 微 生 物 学 报 46(2)：285—291 2006年4月4日 ActaMicrobiologicaSinica 4April2006 家蚕肠道细菌群体调查与分析 袁志辉 ，蓝希钳H ，杨 廷，肖 杰，周泽扬 (‘西南大学农业部蚕桑学重点实验室微生物分室 重庆 400716) (重庆师范大学生命科学学院 重庆 400047) 摘 要：目前，环境微生物中绝大部分是无法获得纯培养的。为了比较全面地了解家蚕肠道的细菌群体结构，研究 采用 了非培养法和传统培养法相结合的方法进行调查分析。非培养法是先直接提取家蚕肠道中的微生物群体基 因组DNA，用 PCR法扩增细菌16SrRNA基因，建立16SrDNA文库；再以限制性片段长度多态性 (RFLP)方法从文库中 筛选可能不同细菌来源的克隆，并测定其核苷酸序列。将所获得的序列与GenBank数据库进行 BLAST比对分析， 并通过系统发育分析，推测它们可能代表的细菌种属，以及对家蚕生长发育所起的作用。结果表明，家蚕肠道中的 细菌主要是节杆菌属、乳杆菌属、大肠杆菌属、芽胞杆菌属、葡萄球菌属 、假单胞菌属。它们在家蚕消化利用桑叶和 疾病预防中可能有着重要意义。非培养法和培养法均有各 自的长处和不足，两者具有较强的互补性 。 关键词：家蚕肠道细菌；群体基因组DNA；16SrRNA；非培养法 中图分类号：Q938 文献标识码 ：A 文章编号：0001—6209(2006)O2．0285—07 家蚕作为一种重要的经济动物与鳞翅 目昆虫研 核糖体 RNA序列的比对分析为人们寻找微生物间 究模型…，具有生长快 、周期短 的特点。在幼虫期 的进化关系提供了一条更有效 的途径 J，使人们能 20多天时，家蚕除了本身具有消化食物的能力之 够绕过培养障碍 ，把研究对象深入到 目前还未能培 外 ，肠道中种类繁多、数量巨大的微生物群体也对其 养的微生物领域中去。 食物的消化和营养的吸收起重要作用 。同时，由于 本文先采用非培养法，直接提取家蚕肠道微生 长期驯化的结果，家蚕防病能力极其脆弱；肠道 内有 物群体 基 因组 DNA，通 过 PCR．RFLP法 对 细菌 益菌群的存在 ，能够有效地帮助家蚕抵制内源性细 16SrDNA进行序列分析；同时，与传统纯培养法相结 菌病害的侵袭。因此 ，肠道里 的微生物对家蚕具有 合，探讨 了家蚕肠道的细菌群体结构及其对家蚕生 重要意义。 长发育的影响，以及两种方法的优势与不足。 早在 20世纪60年代，Et本的潼泽义郎、河北俊 1 材料和方法 彦等 就对家蚕肠道内细菌进行过一些研究。在 国内，孙雪奇等 研究了家蚕肠道的部分微生物 ，并 1．1 材料 制成微生态制剂 ，用于降低幼蚕发病率和提高对桑 1．1．1 家蚕肠道样品：取 150头5龄家蚕 (品种为 叶的利用率；易发平等 研究了家蚕肠道微生物好 大造)，饥饿过夜。依次用 70％乙醇和火焰灼烧进 氧菌群。但这些研究都是按照传统的微生物研究方 行体表消毒 ，无菌条件下剖取家蚕肠道内容物 ，置于 法，即先要分离培养肠道中的微生物，然后再对它们 灭菌的离心管中。将其 中80头蚕中的每 10头的肠 进行研究。 道内容物作为一个提取单位，分 4次、2种方法提 然而，近几十年来的分子生物学研究表明，99％ 取。另外 70头蚕的肠道