检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的初步的分析.pdf

硕士掌位论文 检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的初步研究 中文摘要 检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的初步研究 硕士研究生吴菁 导师黄艳仪教授陈小蔓副主任医师 摘要 近几十年来，遗传病和先天畸形的发病率相对升高，对人类健康的威胁已日益严重。 众所周知很多遗传性疾病和先天畸形是无法治愈的，要求在产前做出诊断，及早采取适 当的措施。降低出生缺陷率。目前I临床上产前诊断的取材方法大多是创伤性的，它们对 产妇和胎儿都不同程度的存在着流产、感染等不安全的因素，故产前诊断的对象仅限于 某些高危妊娠的孕妇，对整个人群出生缺陷率的降低意义不大。多年来许多学者一直探 求将非创伤性的方法用于产前诊断，使之可以应用于大规模的人群，降低出生缺陷率， 对于提高人口素质具有重大意义。 在妊娠期间胎儿的血液循环和母体的血液循环被胎盘膜隔开，但各种证据显示母血 中存在着胎儿细胞，表明胎盘并不能完全阻碍细胞通行，这就提示可以利用母体血液作 为产前诊断胎儿疾病的底物。 受到肿瘤病人血浆中存在肿瘤DNA的启发，Lo等(1997年)开始在母体血浆和 血清中寻找胎儿DNA，他们用普通PCR的方法，在怀有男性胎儿的孕妇血浆和血清 DNA中扩增出特异性Y染色体DNA序列，首次证实了孕妇血浆和血清中存在胎儿 DNA，表明孕妇血浆和血清是胎儿DNA和母体DNA的嵌合性混合物，提示孕妇血 浆中的DNA是进行非侵入性产前诊断的另一种有价值的底物。1998年Lo用实时定量 PCR技术通过检测孕妇血清和血浆中性别决定Y(sex_detennining region，SRY)基因， 测定了胎儿DNA的浓度，发现胎儿DNA的绝对浓度随孕龄而增高，并在妊娠期末急 剧升高，而且在孕7周就可以在母体血浆中检测到胎儿DNA。通过对分娩后的孕妇进 行研究，发现胎儿DNA从母体血浆中清除的半衰期平均约为16．3分钟，肾脏可能在血 浆清除中起作用。 目前有几种可能的机制解释母体血浆中胎儿DNA的来源：一种机制是，胎儿细胞 硕士掌位论文 检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的初步研究 中文摘要 穿过胎盘屏障不断的漏出到母体血液循环中，同时被母体的免疫系统破坏，释放出DNA 留在母体血浆中。另一种机制是，在胎儿的发育过程中，存在与发育相关的程序性死亡 即凋亡，胎儿细胞的凋亡导致胎儿细胞不断裂解，将DNA释放到母体血浆中。凋亡的 启动过程可自发启动或受到外界刺激引发凋亡的启动。 分离母体血浆和血清中胎儿DNA的主要应用于以下几方面：l、遗传性疾病(性连锁 遗传病、父系遗传病、唐氏综合征)2、R_h(D)血型不合溶血3、妊娠相关性疾病。 综上所述，利用孕妇血浆中的胎儿DNA进行产前诊断，为非创伤性产前诊断开辟了 新的道路，有非常重要的临床意义。本研究的目的在于研究如何检测母体血浆中胎儿 DNA，在孕早期做出产前胎儿性别诊断，并进一步探讨不同孕周的正常孕妇其血浆中胎 儿DNA的量和浓度是如何变化的，为将来应用于非创性产前诊断作初步研究。 本研究分两部分，第一部分用定性检测母体血浆中的胎儿DNA，证实母体血浆中存 在胎儿DNA，可以在早孕期做出性别诊断。第二部分是用定量检测母体血浆中的胎儿 第一部分： 定性检测母体血浆中的胎儿DNA 作产前诊断、足月待产的初产妇共38例，在术前或末临产前取肘前静脉血10ml，乙二 te胁cefic divine acid，EDTA)抗凝，经离心分离血浆。用苯酚、氯 胺四乙酸盐(ethylene 仿、异戊醇提取血浆中DNA后，选择Y染色体上的SRY基因，用巢式PCR扩增。用正 常未孕女性和正常男性DNA分别作阴性对照和阳性对照。同时取人流术中吸出的绒毛 作染色体培养、羊膜腔穿刺术抽取羊水作染色体培养以及出生胎儿的实际性别验证结 果。 出现扩增带为阴性。这13例阴性样本进行第2次扩增后有6例出现254bp扩增带为阳性， 7例未出现扩增带为阴性。根据两次扩增后结果判定怀有男性胎儿的孕妇为13例，怀有 第1次扩增的阳性率为58．33％，无假阳性；第2次扩增的阳性率为100％，假