5基因工程和其应用.ppt

* 质粒分离的步骤： 粗提 精提 * 氯化铯梯度离心法： 有效地去除蛋白质、RNA、染色体DNA、受损质粒。 * 二、l噬菌体克隆载体 1、优点 遗传学背景十分清楚 载体容量大，~23kb 具有较高的感染效率 2、类型 插入型载体:较小片段DNA的插入（10kb以内）； 取代型载体：较大片段DNA的插入； 重组DNA分子大小为l噬菌体DNA的75～105％；野生型λDNA为 48kb，λ噬菌体的包装上限是 51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。 * 插入型载体 * 取代型载体 * 3、 l噬菌体克隆载体的导入 转染：用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。 效率低：未经任何基因操作处理的新鲜制备的λDNA，其典型的转染效率也仅为 105～106噬菌斑/微克λDNA，体外连接的结果，转染效率便下降到了104～103左右。 λDNA的体外包装：在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒，形成有感染功能的病毒载体。 * 三、柯斯质粒载体(cosmid vector) 由l噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，来自l噬菌体粘性末端的DNA片段（cos位点）。 * 优点 具有l噬菌体的特性，在体外包装后具有噬菌体的高效感染力； 具有质粒DNA的复制方式； 具有克隆大片段外源DNA的能力(45kb)； 具有与同源序列的质粒进行重组的能力 * 柯斯克隆（cosmid cloning） 应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术 * 第三节 基因工程的基本操作 一、目的基因的获得 1、从供体细胞的DNA中分离 （基因文库的构建） 基因文库：某生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。 如“鸟枪法”(Shotgun Method) * 步骤 提取染色体DNA 限制酶解 电泳分离 与载体连接 导入宿主 筛选阳性克隆 * 2、从mRNA合成cDNA (cDNA文库构建） 所谓cDNA文库是指某生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。 * 步骤 提取mRNA 反转录合成cDNA第一链 合成cDNA第二链 与载体连接 导入宿主细胞 筛选阳性克隆 * 3、PCR体外扩增目的基因 PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链式反应：利用特殊的DNA聚合酶，在体外扩增位于两段已知序列之间的特定DNA区段的方法。 (1) PCR组成： 含目标DNA序列的模板DNA 寡核苷酸引物 DNA聚合酶：Taq 或 Pfu dNTPs 缓冲体系和金属离子 * (2) PCR过程 变性( denaturation)：90℃以上 退火( annealing)：40~60 ℃ 延伸(extension)：72 ℃ 如此进行20~40 个循环，DNA量扩增106~107倍。 * * * * * 第五章 基因工程育种Genetic engineering 基因工程是将不同生物的基因在体外人工剪切组合，并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。 * 奠定基因工程的三项关键技术 DNA的特异切割 Smith 和Nathans 获1978年诺贝尔医学奖 DNA的分子克隆 Berg（1972）将猴病毒SV40 DNA与λ噬菌体基因融合，成功构建重组DNA； Cohen 和Boyer （1973）将质粒pSC101与R的tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli，首次实现了DNA的分子克隆。 DNA的快速测序 Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法DNA快速测序技术 1980年诺贝尔化学奖：Berg, Gilbert, Sanger * 分离或合成基因； 通过体外重组将基因插入载体； 将重组DNA导入细胞； 扩增克隆的基因； 筛选重组体克隆； 对克隆的基因进行鉴定或测序； 控制外源基因的表达； 得到基因产物或转基因动物、转基因植物 基因工程操作的主要步骤 * 第一节 基因克隆的酶学基础 一、限制性核酸内切酶restrictive endonuclease 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。 核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase) 核酸外切酶：exonuclease 核酸内切酶：endonuclease * 1、寄主控制的限制与修饰作用 （1）寄主控制的限制作用(Restriction) 作用：破坏外源