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流式细胞术的参考样品 河北省肿瘤研究所 * * 一· 参考标准样品在FCM使用的意义 参考标准样品在FCM中使用，为了监测仪器的液流·电子和各个光学系统的稳定性，校正和调试仪器的CV值，最大限度的提高仪器的分辨能力． 1.调整仪器在高性能的状态下工作。 2.由于FCM的测量是相对的，而不是绝对的，所以参考细胞有助于单个样品或一组样品的测量参数的解释。 3.参考标准细胞可供监测工作状态下仪器的稳定性，以使所测参数具有可靠性和可比性。 4·参考细胞可被用于监测染色过程。 5·能够用于校验FCM分选术的回收和纯度。 参考细胞的主要作用如下: 二、 标准细胞样品具备的特性 一个标准样品，应具有较恒定的体积大小 具有较恒定荧光发射量子 细胞的形状较一致 在液流中的流动取向较一致 在悬液中可保持高度的单分散状态，放置较长时间不会聚集、不改变其形状、体积大小及其光学特性 1. 外标法 标准样品在流式分析实验样品前或后，上仪器测量，以校正仪器在工作条件下稳定性。 缺点 由于参考样品与实验样品不同步染色，以及在实验过程中仪器条件的漂移，可能引起定量检测的误差，因此，近年在流式细胞定量检测中已被摒弃。 参考标准的使用方法 2. 内标法 内标法是将标准样品与实验样品按一定的细胞数混悬在一起进行同步染色,这种方法可以避免外标法引入的误差,可以避免因染色、光源强度的瞬时波动，以及细胞流速的变化和流束与激光束焦点的漂移造成的实验结果偏差。 内标法可保证标准样品与实验样品在同样条件下制备和测量，可使测量误差降到最小限度。内标法在流式细胞测量术中已广泛应用。 三、参考样本的制备方法 ㈠非生物标准样本 塑料微球已广泛应用于参考标准样品，这些塑料小球可分为两种： 1. 无荧光塑料小球 可用于散射光的校正，此种统一大小无荧光微球，对于校正仪器光散射是非常有用的。最好采用10μm大小（与正常人淋巴细胞大小相似），通过微球大小的测量，可以对实验样品细胞的面积，直径，横截面积和体积作出相对大小的判断。 2. 标记有荧光染料的塑料微球 标记荧光染料多选用PI、EB、FITC、AO等，荧光染色的塑料微球可用于调整和监测光散射和荧光信号的检测。对不同荧光染色细胞所结合的荧光的数目和细胞体积的大小进行较准确的计算。 流式细胞仪对于微球分辨率的大小，取决于微球大小是否一致，分辨率的大小一般用变异系数(Coeffience of Variation CV)来表示，目前有的生产厂家出售的商品微球已标明cv值。 美国生产微球有如下公司的产品： 1.DOW Diagnostics 2.02μm 2.PolyscienCes Inc 400　Valley Road Warrmgton PA 18979 1.75 μm 3.Becton Dickinson Conpany Production 1.75 μm,2.02 μm 以上几种微球在FACS仪器上，光散射CV值为1.2%，荧光CV值为2.2%(为浅黄色荧光)。 4.Duke Standard SamPLe 5.1 μm 5.Counter Electronics Inc 10 μm 这两种微球的CV值为光散射2%，荧光2.8%。 非生物性塑料小球可作为长期使用于流式的标准样品，其配制方法和保存方法根据出售厂家的产品说明。但各种微球多要避光保存，因白炙光可使荧光微球的荧光淬灭。在冰箱内保存要防止冷冻结冰和悬液干燥破坏微球，在长期使用过程中或换批号使要做对比鉴定。 ㈡生物性标准样品 1. 某些生物性颗粒 可作为短期标准，例如植物花粉、一些真菌等，可作为体积大小的光散射标准，但是由于其准确性较差，产生误差较大，且在水中不易保存和易发生体积大小、光学型号特征等方面的变化，因此很少在流式细胞术中使用。 ⑴鸡红细胞的制备： 鸡红细胞在体内为一终末细胞，其DNA含量是均一致的，相当于正常人淋巴细胞(二倍体细胞)DNA含量的35%，流式细胞术测定其DNA含量分布组方图。所得结果为单一狭窄、对称的正态峰，在前向光散射组方图上表现为两个正态峰。出现两个光散射正态峰的原因是鸡血红细胞呈盘状，在流过光探测敏感区时，由于细胞所处的取向不同，造成前向光散射强度不同，因此在光散射组方图上出现不同大小的光散射信号，即呈两个正态分布的组方图。 ２．生物细胞标准样品 鸡血红细胞即可作为DNA内参标准，也可以作为调整仪器的标准样品，美国Stanford大学医学部成功的使用鸡血红细胞调试仪器，其CV值最好可达2%，用戊二醛固定的鸡红细胞可发出自发荧光，在不染色的条件下，其激发光谱和发射光谱与荧光素和罗丹明极接近，美国Beckton Dickison生产的FACS仪器上，其荧光分布的单峰CV值在10%左右。 鸡血红细胞作为内参标准样品，