聚丙烯酰胺凝胶电泳29629.ppt

（1）丙烯酰胺结构式 C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。 * * 聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE Li Li 一、PAG 的 组成 PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylene bixacrylamide，Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。 Acr + Bis? 多孔三维网状结构 （2）亚甲双丙烯酰胺 二、PAG 的 聚 合 需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。 （一）化学聚合：AP-TEMED系统 过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。 AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。 注意： ?TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 ?分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 ?升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合 （二）光聚合：核黄素-TEMED系统 核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意： 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。 三、PAG的浓度与孔径的关系 PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性； ＜10 很脆，易碎，不透明； ＞100 糊状不成形，易破碎。 凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。 四、不 连 续 PAGE 按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳 按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE Disc 有防对流作用 ?T=3% C=20%单体 ?欲分离的样品溶液 ?pH6.7 Tris-HCl缓冲液 混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶 样品胶 作用 成分 电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液 Disc样品在此胶中被浓缩 除不加样品外，其余组成成分同样品胶相同 浓缩胶 作用 成分 Disc主要的电泳分离部分 ?T=7%C=2.5%单体溶液 ?pH8.9 Tris-HCl缓冲液 化学聚合法聚合成小孔胶 分离胶 作用 成分 分 离 原 理 1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性 两层凝胶T与C不同?孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。 2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（?）很小，有效迁移率（M ?）很低，移动速度较慢，称为慢离子。 HCl 是强电解质，?=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。 蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。 pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液 甘氨酸 HCl 蛋白质 样品胶 浓缩胶 分离胶 样品 低电导区 3）pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。 3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，