《SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳》.ppt

实验八 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的工作原理和操作方法 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8，AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7 Tris-HC1。分离胶是小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子或慢离子：甘氨酸根 mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m?，m为迁移率，?为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； （c)电位梯度的不连续性： 不连续系统浓缩效应示意图  三、试剂与器材 试剂：10%SDS、 凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis) 分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲液） 浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液） 10%过硫酸铵 10%TEMED pH8.3 Tris-Gly电极缓冲液 0.05％考马斯亮兰R250 7%醋酸 1%琼脂糖凝胶 器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床 1.安装夹心式垂直板电泳槽 安装好后，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂糖中应避免有气泡。 3. 制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL移液器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。 将上、下贮槽的蒸馏水倒去，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻插入样品槽模板梳子。在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出梳子，即可加样。 4. 样品的处理及加样 将样品按4:1的比例加蛋白上样缓冲液（5×），混匀后，在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。 用微量进样器取5 ?l上述混合液，小心地将样品加到梳孔内。 5 .电泳 连接好电泳仪的正极和负极打开电泳仪开关，开始时电压为60 V，待样品进入分离胶后，将电压调至100V，当染料距胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。 6 .染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用小刀或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下左上角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰。 五、实验结果 六、注意事项 （1）安装电泳槽时要注意均匀用力，避免缓冲液渗漏。 （2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 （3）加样时样品不能超出样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g ； (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖