《琼脂糖凝胶电泳-完整整理版》.ppt

影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小 1 凝胶的浓度 2 DNA的构象 3 使用的电压 4 琼脂糖的种类 5 电泳缓冲液 6 嵌入染料的存在 7 低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5-8V/cm 影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小 1 凝胶的浓度 2 DNA的构象 3 使用的电压 4 琼脂糖的种类 5 电泳缓冲液 6 嵌入染料的存在 7 包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。 琼脂糖凝胶的浓度 影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小 1 凝胶的浓度 2 DNA的构象 3 使用的电压 4 琼脂糖的种类 5 电泳缓冲液 6 嵌入染料的存在 7 溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向; 溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNA不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔化，也会使DNA变性。 影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小 1 凝胶的浓度 2 DNA的构象 3 使用的电压 4 琼脂糖的种类 5 电泳缓冲液 6 嵌入染料的存在 7 染色剂溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加，因此，线性DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15%。 DNA电泳常见问题分析 问题 原因 解决办法 DNA带模糊 1) DNA降解 避免核酸酶污染 2)?电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液 3)?所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 4) DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量 5) DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 6)?有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白 7) DNA变性 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA DNA电泳常见问题分析 问题 原因 解决办法 不规则DNA带迁移 1)?对于λ/Hind III片段cos位点复性 电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟 2)?电泳条件不合适 电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液 3) DNA变性 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热 带弱或无DNA带 1) DNA的上样量不够 增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低 2) DNA降解 避免DNA的核酸酶污染 3) DNA走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 4)?对于EB染色的DNA，所用光源不合适 应用短波长（254nm）的紫外光源 DNA电泳常见问题分析 问题 原因 解决办法 DNA带缺失 1)?小DNA带走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 2)?分子大小相近的DNA带不易分辨 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度 3) DNA?变性 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA 4) DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析 分子生物学实验技术专题 电泳技术简介 什么是电泳技术？ 电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。 电泳技术的分类 电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。 自由电泳包括 Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。 区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。 凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳：实验原理 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。 琼脂糖凝胶电泳：实验原理 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同