《琼脂糖凝胶电泳》.doc

琼脂糖凝胶电泳 v琼脂糖凝胶电泳是采用琼脂糖凝胶作为电泳支持物的一种简单、快速分离纯化和鉴定核酸特别是DNA的方法。 ?琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取出来的，为一种聚合链线性分子。琼脂糖凝胶的孔经较大，主要用于分离较大片段的DNA分子（100bp～60kb）。 电泳基本原理 与蛋白质分子相类似，核酸分子也是两性电解质。 ⑴在pH3.5时，核酸分子带正电荷，在电场中向负 极移动； ⑵在pH8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。 ⑶ 不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。但采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率产生较大的差别，则可达到分离的目的。 ⑷ DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范围内是分子质量的函数，分子质量越大，移动越缓慢。因此，利用琼脂糖凝胶电泳相对于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相对分子质量。 琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围 胶浓度（％） 线性DNA分子大小（kb） 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～4 2.0 0.1～3 二、仪器设备及材料 1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、 胶床和梳子三部分组成。 2、稳压电泳仪：电压可变范围0～300～600V，电流可变范围0～250～500mA。 3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm 3个波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色有机玻璃防护板。 4、照相机： 5、微波炉： 6、其它：三角烧瓶、量筒、胶带纸、一次性手套等。 主要试剂 1、琼脂糖：根据需要用电泳缓冲液配成不同浓度。 本实验配制 2％ Agrose： 2g Agrose 100ml 0.5×TBE EB少许（终浓度0.5μg/ml） 2、电泳缓冲液： 常用的缓冲液有TBE、TAE和TPE三种。 本实验选用TBE，先配制5×TBE 贮存液： 54g Tris碱 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0) （或4.65g EDTA） 加dd H2O至1000ml。用时稀释为0.5×TBE。 3、6×上样缓冲液： 4℃贮存 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青FF 30％ 甘油水溶液 4、10mg/ml 溴化乙锭（EB）：贮存液 在100ml水中加入1g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时确保其完全溶解，棕色瓶室温保存。 ?溴化乙锭（EB）染色原理： 溴化乙锭是一种荧光染料，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。这是因为： ①在紫外线照射时，核酸吸收波长为254nm的紫外线并将能量传递给溴化乙锭； ②同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收302nm和366nm波长的紫外线，来自两方面的能量最终激发出波长为590nm的红橙色可见荧光。 ? 溴化乙锭用于核酸染色的优点： ⑴染色操作简单，一般在凝胶中加入终浓度0.5μg/ml的EB即可，在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动。也可在电泳结束后，将凝胶浸泡在EB里30分钟即可。 ⑵EB染色不会引起核酸的断裂，其它染料做不到这一点。 ⑶EB染色灵敏度较高，可以检测出10ng的DNA样品。 ?溴化乙锭缺点： EB是一种强诱变剂，并有中度毒性。 注意：①操作中务必带上防护用手套。 ②如不慎皮肤与溶液接触，应立即用清水彻底冲洗。 ③含溴化乙锭的溶液使用后应进行净化处理，使其