钠泵α1亚基M3-M4膜外区特异性结合肽的筛选及其生物学活性的研究.pdf

中文摘要 钠泵Q1亚基M3．M4膜外区特异性结合肽的筛选 及生物学活性研究 摘 要 子转运的跨膜载体蛋白，它由O【、p、Y三个亚单位组成，其中a亚基具有 酶的活性。cL亚基有o【1、0【2、0【3、0【4四种亚型，各个亚型的基本结构高 度保守，都有10个跨膜区即M1一M10。其膜外区序列含有多种钠泵调节 因子的结合位点，包括内源性钠泵抑制剂…．哇巴因的结合位点。目前认 为，伐亚基的第二个跨膜区M3．M4是哇巴因的一个重要结合位点。哇巴 因与钠泵结合后，抑制钠泵活性，进而促使血压升高。因此，本研究将从 噬菌体随机肽库中筛选钠泵O【l亚基M3．M4膜外区特异性结合肽，通过 此结合肽来封闭哇巴因M3．M4结合位点，竞争抑制哇巴因与钠泵的结合， 并通过检测此钠泵结合肽对内皮细胞和SHR大鼠血压的作用，进一步探 讨钠泵与其抑制因子的可能作用机制，为高血压的治疗提供理论和实验依 据。 一、 钠泵ql亚基M3．M4膜外区结合肽的筛选 目的：以钠泵仪1亚基M3．M4膜外区蛋白为靶标，从噬菌体随机12 肽库中筛选出能与之特异性结合的多肽，以拮抗哇巴因对钠泵的抑制作 用，并检测此特异性结合短肽与哇巴因是否竞争抑制关系。 靶蛋白，利用噬菌体随机12肽库技术，通过3轮“吸附．洗脱．扩增”的 淘选，使与靶蛋白特异性结合的噬菌体得到大量富集。(2)双夹心ELISA 实验鉴定噬菌体阳性克隆：以钠泵0Ll亚基M3．M4膜外区序列 30个噬菌体原种上清，加HRP．抗M．13抗体，显色后于420nln测定OD 克隆扩增后测定滴度，加入～1012 pfu的噬菌体并进行5倍系列稀释，加入 中文摘要 末端序列”，确定插入片段的基因序列，参照“遗传密码表”翻译出筛选 多肽序列。(5)哇巴因竞争性抑制试验：将待鉴定的噬菌体上清进行2倍 系列稀释，各取50皿与50 vL100“g／mL哇巴因混匀，放入己包被靶蛋 白的酶联板中，同时设阴性对照，加入HRP．抗M．13抗体，显色后测定 OD值，以稀释倍数对吸光度作图。 结果：(1)噬菌体随机12肽库筛选结果：3轮生物筛选中，阳性噬菌 体的产出与投入比率逐轮提高，表明筛选出的噬菌体得到了选择性的富 与阴性对照孔OD比值≥2．1，确定为阳性克隆。(3)浓度依赖性实验：从 稀释倍数对吸光度的图中看出，21个阳性克隆均具有浓度依赖性，提示 体克隆的ssDNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示，目的条带7500 bp 左右与噬菌体DNA大小相符。测序结果表明，21个阳性噬菌体包含3种 结果表明，相同浓度的噬菌体上清，在哇巴因存在的情况下，其OD值比 阴性对照降低；随着噬菌体上清中结合肽浓度的降低，其对畦巴因与靶蛋 白结合的竞争力亦逐渐降低，说明结合肽与哇巴因是竞争抑制关系，筛选 到的结合肽能够特异性地与钠泵仪1亚基M3．M4膜外区的表位识别位点 厶士厶 ；口口。 蛋白，从噬菌体随机十二肽库中成功获得了能够与之特异性结合的多肽 治疗奠定了基础。 二、钠泵结合肽的生物学活性分析 目的：检测钠泵结合肽对哇巴因刺激血管内皮细胞增殖或凋亡的影 2 中文摘要 响，并检测钠泵结合肽对自发性高血压大鼠(S珈R)血压的影响，探讨该钠 泵结合肽在高血压病治疗中的应用价值。 血管内皮细胞增殖的影响：取96孔板各组细胞，分别加入生理浓度 以不加钠泵结合肽组为阴性对照。培养24、48、72h后，加20皿MTT， nm处吸光度 继续培养4h后，弃上清，加入DMSO，于酶标仪测定570 值。(2)用流式细胞术检测钠泵结合肽对高浓度哇巴因刺激血管内皮细胞 凋亡的影响：取完全贴壁的各瓶细胞，分别加入高浓度(10～，10曲mol／L) 的哇巴因及10’4mol／L的钠泵结合肽，以不加钠泵结合