布氏杆菌BP26蛋白的表达纯化及其免疫学特性的研究.pdfVIP

布氏杆菌BP26 蛋白的表达纯化及其免疫学特性 的研究 1 1 2 2 3 3 宫晓炜 ，景涛 ，王国治 ，李恪梅 ，王秉祥 ，傅林锋 1 兰州大学病原生物学研究所，兰州 （730000 ） 2 中国药品生物制品检定所，北京（100050 ） 3 兰州生物制品研究所，兰州（730046 ） E-mail ：gxw0921@126.com 摘 要: 目的：获得布鲁氏杆菌感染血清学诊断优势抗原BP26 重组蛋白。方法：应用PCR 技术从布氏杆菌减毒株(104M) 中扩增出bp26 目的基因片段，将其克隆于表达载体PET30a 中，并转化入大肠杆菌BL21(DE3) 中，IPTG 诱导表达，用亲和层析纯化BP26 重组蛋白， 然后分别用Western-blot ，间接ELISA 检测其免疫原性。结果：DNA 测序及酶切鉴定证实 PET-30a/bp26 原核表达载体构建成功，并在大肠杆菌中高效表达，免疫印迹和间接 ELISA 实验证明BP26 重组蛋白可与布氏杆菌阳性血清产生特异性结合，是布氏杆菌血清学诊断的 优势抗原。 关键词：布氏杆菌；BP26 重组蛋白；免疫原性 中图分类号：R37 1. 引言 布氏杆菌病，是由布氏杆菌属细菌引起的，在全世界广泛分布的人畜共患病。有牛种布 氏杆菌（B.abortus ，含9 个型），羊种布氏杆菌（B.millitensis ，含3 个型），猪种布氏杆菌 （B.suis ，含5 个型），绵羊副睾种布氏杆菌（B.ovis ）；沙林鼠种布氏杆菌（B.neotomae ） 和犬种布氏杆菌（B.canis ）6 个种，20 个生物型[1] 。其中对人类危害较大的是羊种布氏杆 （B.millitensis ）、牛种布氏杆菌（B.abortus ）和猪种布氏杆菌（B.suis ）。 布病患者临床表现复杂而多变，易与上呼吸道感染、结核菌感染、病毒 性肝炎、风湿病等相混淆，可引起低热、乏力、流产、不育、慢性关节炎和神经损害等，医 生的误诊和病人的不及时治疗会使疾病转变为慢性，导致多个系统器官受累[2] 。但目前，临 床布氏杆菌检测的金标准是细菌学检测，此方法费时费力，不能做到早期快速诊断[3] 。现有 血清学技术所选用的三种常用抗原，如：菌悬液制备简单，有较高的诊断价值，但是特异性 不高，结果判定不易量化，易发生漏诊。LPS是公认能刺激机体产生抗体的，国外也有报道， 用未纯化的S-LPS为包被抗原，采取间接ELISA法检测布氏杆菌感染和Rev-1接种的羊群，可 [4]，但是它和其他菌以及同一菌的不同属之间存在共同抗原成分， 以引起明显的血清学反应 不能排除实验结果中假阳性的可能[5] 。纯蛋白衍生物虽然纯度较前两者高，毒副作用小，特 异性较高、敏感性好[6]，但不能排除与耶尔森氏菌O9型的血清学交叉。此外三种抗原均直接 采用布氏杆菌菌体本身或提取培养物，生产与制备过程涉及活菌的培养，存在一定的生物安 全危险，须采取严格的生物安全措施，提高了生产制备的成本。因此，寻找一种制备更方便、 更安全、特异性、敏感性更好的抗原用于布病的早期快速诊断尤为重要。 BP26 是一种具有强免疫原性、可以由细胞内向外释放的可溶性外周浆蛋白，相对于固 定的外膜蛋白来说，具有易于检测的优点。根据国外文献报道[7]，在诊断布病时，用重组的 BP26 蛋白代替从布氏杆菌粗提的蛋白有以下优点（1）BP26 是其它可能干扰诊断试验的布 氏杆菌属抗原中游离出来的有效成分（2 ）获得重组的BP26 蛋白耗时少且产量高（3 ）可以 避免布氏杆菌强毒株的培养及控制。通过间接酶连免疫吸附实验发现重组的BP26 蛋白是山 - 1 - 羊、绵羊布氏感染补体结合试验以及区分感染羊群