《实验四 柱层析分离》.ppt

实验四 柱层析分离芦丁和槲皮素以及聚酰胺TLC鉴定芦丁和槲皮素 一 、实验目的 掌握用聚酰胺柱层析分离芦丁和槲皮素的方法。 二、实验原理 二、实验原理 根据聚酰胺的“双重功能”来进行分离。 一）．比较黄酮苷 1. 展开剂的极性较大（水溶性溶剂所占比例50%）时，如：含水醇或水：甲醇：丁酮：乙酰丙酮=65：15：15：5; 洗脱先后顺序: 三糖苷双糖苷单糖苷苷元 理论: 用反相色谱理论来解释。 二、实验原理 2）. 展开剂的极性较小（脂溶性溶剂所占比例50%）时，如：苯：丁酮：甲醇 = 60：20：20; 洗脱先后顺序: 极性小的先洗脱，极性大的后洗脱。 用正相色谱理论来解释。 二、实验原理 二）．黄酮苷元之间的比较： 用氢键吸附的原理来解释。 二、实验原理 本实验利用聚酰胺在乙醇-水系统中，洗脱原理与RP-18的洗脱原理类似，因此，芦丁先从聚酰胺柱上洗脱出来，槲皮素后从聚酰胺柱上洗脱出来。 三．实验操作步骤 （一） 柱层析分离芦丁和槲皮素 三．实验操作步骤 2. 加样 芦丁和槲皮素各0.03g ,加甲醇2ml溶解，加聚酰胺0.03 g，在水浴上除尽甲醇，将所拌样品轻轻的置于柱上端。 三．实验操作步骤 4. 收集 用试管收集，每试管接收30 ml。 5. 检测 分离结果用TLC检测。 （二）芦丁和槲皮素聚酰胺色谱柱层析后的试样进行聚酰胺薄膜层析操作 1. 配制展开剂，甲醇：丙酮：苯＝8：1：1 2. 将展开剂倒入展开缸中，展开缸中展开剂的高度4mm左右。 3. 画基线，基线距底边1.0～1.5cm； 4. 点样（点样顺序：试样1、试样2、芦丁、槲皮素)，点样一般为圆点，点样直径一般不大于2 mm，点样时必须注意勿伤薄层表面。 （二）芦丁和槲皮素聚酰胺色谱柱层析后的试样进行聚酰胺薄膜层析操作 5. 将点好样品的聚酰胺薄膜放入展开缸中无展开剂的一侧预饱和15min。 6. 倾斜展开缸，使展开剂到入展开缸的另一个槽中，聚酰胺薄膜浸入展开剂的深度为距圆点5 mm为宜，一般展距为8 cm,取出薄层板，晾干。 7. 喷1％的AlCl3显色。 8. 实验结果见图1。 四．体会与讨论 1. 画出聚酰胺薄膜层析鉴定芦丁和槲皮素分析图　 * 1. 槲皮素与芦丁的结构 槲皮素 芦丁 　1. 装柱 聚酰胺5g，加水50ml，搅匀，倒入层析柱中（打开层析柱活塞，让水滴出，让聚酰胺自由沉降而填实。注意保持液面1cm高度。） 3. 洗脱 加好样品后，先用50%的乙醇冲洗， 待两层析带之间的距离约1cm后，再用90%的 乙醇冲洗。 *