《第七章 层析》.ppt

层析技术 第七章 层析技术 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第一节 层析的基本原理及分类 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第二节 凝胶过滤层析 第三节 离子交换层析 第三节 离子交换层析 第三节 离子交换层析 第三节 离子交换层析 第三节 离子交换层析 第三节 离子交换层析 第四节 疏水性相互作用层析 第四节 疏水性相互作用层析 第四节 疏水性相互作用层析 第四节 疏水性相互作用层析 第四节 疏水性相互作用层析 第四节 疏水性相互作用层析 第四节 疏水性相互作用层析 第四节 疏水性相互作用层析 第四节 疏水性相互作用层析 第五节 亲和层析 第五节 亲和层析 第五节 亲和层析 第五节 亲和层析 第五节 亲和层析 第五节 亲和层析 第五节 亲和层析 第五节 亲和层析 第六节 反相层析 第六节 反相层析 第六节 反相层析 2．脱盐 GFC在生物分离领域的另一主要用途是生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分于质量物质。例如，经过盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高，一般不能直接进行离子交换层析分离，可首先用GFC脱盐。此外，GFC还用于溶解目标产物的缓冲液的交换。生物物质的分离纯化需要多步操作，上一步操作所用缓冲液有时不适合于下一步单元操作的有效实施(例如，某些盐离子抑制蛋白质在亲和吸咐剂上的吸附)，必须进行缓冲液的交换。若将缓冲液A换成缓冲液B，可先用B液冲洗GFC柱，上样后用B液洗脱，即可完成缓冲液的交换。 3．相对分子质量的测定 GFC中溶质的分配系数m在分级范围内随相对分子质量的对数值增大而线性减小，分配系数与相对分子质量Mr之间存在如下关系： m＝a-blogMr （7-1） 在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数(或洗脱体积)与相对分子质量的对数呈线性关系，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。首先用标准蛋白质如细胞色素C(12500，指分子量，下同)、肌红蛋白(16900)、胰凝乳蛋白酶(23200)、卵白蛋白(45000)和血红蛋白(64500)等分别进行凝胶过滤层析实验，确定分配系数与相对分子质量的关系式。然后测定未知物质的洗脱体积(分配系数)，就可推算其相对分子质量。不过，GFC仅对球形分子的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。 4．凝胶层析的特点 与其他层析法相比，GFC的最大特点是操作简便，凝胶过滤介质相对价廉易得，适合于大规模分离纯化过程。因此，GFC在生物大分子的分离纯化过程中应用最为普遍，尤其被广泛应用子分离纯化过程的初级阶段以及最后成品化前的脱盐。GFC的具体优点如下： ①溶质与介质不发生任何形式的相互作用。因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100％； ②每批操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度； ③作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高，与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高； ④分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。 与其他层析法相比，GFC的不足之处在于： ①仅根据溶质之间相对分子质量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小； ②经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作(如超滤、离子交换和亲和层析等)后使用。 一、原理与操作 1．离子交换层析的原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography，IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间