《第九章 凝胶过滤及离子交换层析介质》.ppt

第九章 凝胶过滤及离子交换层析介质 广州大学生命科学学院 柯德森 一.凝胶过滤介质 凝胶过滤:利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法. 其基本原理是含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后,较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部.较小的分子可以通过部分孔道,更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部.从而使得小分子移动最慢,中等分子次之,不同分子尺寸的分子先后顺序不同流出层析柱,达到分离的目的. 凝胶过滤的优点 分离条件温和,蛋白质不易变性,收率高,重现性好. 工作范围广,分离分子量的覆盖面大; 设备简单,易于操作,周期短,可连续使用多次. 色谱柱的重要参数 (1) 柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因此柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。 外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。 内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，常用Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。 支持物的体积（Vg）  (2) 峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve 表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。 凝胶过滤的用途 脱盐:用于无机盐和生物大分子的分离.上样量大,为凝胶体积的1/4~1/5,流速大于200cm/h 分级分离:用于分离分子大小相近的物质通常为大分子物质的分离,必须采用孔径适当、分离范围与分子大小相适应的凝胶，上样量小，仅为床体积的5%~10%。 分子量测定 理论上柱长加长 有利于分离效果的提高，但实际上却对操作不利。 流动相 用作流动相的溶剂必须能溶解试样; 与固定相凝胶性质相似，能浸润凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂应能使凝胶溶胀。 溶剂的粘度要低，高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果，尤其是具有低扩散系数的高分子量试样。 一定的离子强度 常用的有四氢呋喃、甲苯、邻二氯苯、二氯乙烷、氯仿、苯、二甲基甲酰胺和水等。 凝胶介质应具备的条件 介质本身为惰性物质，不与溶质、溶剂分子发生任何作用； 应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少特异性吸附，提高蛋白质的收率； 介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄。 凝胶珠粒大小均匀；均一系数?颗粒粗细? 介质要有良好的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒。 凝胶过滤介质的种类 多糖类骨架的介质： 纤维素、葡聚糖及琼脂糖等。是目前生化分离中应用最广、数量最多的凝胶过滤介质。 特点：亲水性及生物分子相容性 缺点：压力降大，不易操作 凝胶过滤介质的种类 合成大分子骨架的介质： 高亲水性，经过共聚反应控制孔径的大小的一类合成骨架。包括聚丙烯酰胺类(Fupergit C,德国)，聚乙烯醇类(Toyppearl,日本)及羟甲基酰胺类等。 天然大分子与合成高聚物构成的混合骨架。 主要的凝胶过滤品种-----交联葡聚糖 （一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴交联葡聚糖是以环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶，其商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克干胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羟丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。 主要的凝胶过滤品种------交联葡聚糖 交联葡聚糖凝胶（Sephadex）的性能： 溶胀性：选用前必须在过量的溶剂中充分溶胀，沸水浴可加速溶胀，但要避免剧烈搅拌； 化学稳定性：不溶于一切溶剂，在水、盐溶液、有机溶剂、碱及弱酸中性质稳定。 物理稳定性：pH中性湿态珠体可经受120C，30min高压灭菌； 机械强度：取决于交联度，高交联度的凝胶为刚性。 主要的凝胶过滤品种---交联葡聚糖 交联葡聚糖凝胶衍生系 Sephadex LH系的用途： 用于有机溶剂的凝胶过滤，尤其适用于嗜脂性分子及制备各种天然产物； 结合凝胶过滤、分配色谱及吸附层析的特点，能分离结构非常相近的分子； 排阻极性与原母体凝胶相同， 分离效果优良，负载量可高达200mg标准样品/ml凝胶 主要的凝胶过滤品种---琼脂糖系 （二