本科生化及分子生物学实验设计.ppt

2011级本科生化及分子生物学实验设计 红细胞葡萄糖—6—磷酸脱氢酶活性测定 2011级护理四大班 1.根据上述患儿的临床表现和实验室调查，初步判断患儿是何种疾病？ 2.设计实验 所以我们只需要测定该患儿红细胞中的G6PD是否缺乏再结合之前的临床变现就可以证明该患儿患的是蚕豆病。 * * 实验课时间：2011.12.5 实验室：第四实验室 组别：3,4组 组员排名：吴彤 叶琴 杨雪琼 吴萍 报告人：吴萍 根据案例中：该患儿一天前食用过新鲜的蚕豆，现出现恶心、呕吐、排尿呈酱油色、面色苍白等症状初步判断该患儿患的是蚕豆病 实验名称：红细胞葡萄糖—6—磷酸脱氢酶活性测定 实验原理：红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）有遗传缺陷者在食用青鲜蚕豆或接触蚕豆花粉后皆会发生急性溶血性贫血症——蚕豆病，致病机制尚未十分明了。已知有遗传缺陷的敏感红细胞，因G6PD的缺陷不能提供足够的 　 NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆种某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损害细胞膜。G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红细胞被破坏而致病 紫外线法： 实验原理：G6PD活性的表示法常用U/l、 U/gHb两种形式。其中U/gHb的定义为：每克血红蛋白在25℃的环境中每分钟产生1μmoL NADPH为1单位（U）。G6PD催化葡萄糖—6—磷酸（G6P）脱氢生成NADPH。NADPH在340nm处有最大吸收峰，血红蛋白被氧化成高铁 血红蛋白在540nm处有最大吸收峰，通过比色法可以计算出NADPH及血红蛋白的含量，从而推算出G6PD的比活性。 实验器材与仪器: 1.实验器材：恒温水循环紫外分光光度计、可见分光光度计、离心机 2试剂： （1）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2 缓冲溶液（pH=8.0） （2）:2mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+） （3）：6mmol/L葡萄糖—6—磷酸二钠（G6P-Na2） （4）：溶血剂 （5）：血红蛋白氧化剂（Drabkin试剂） （6）：0.9％NaCl,ACD抗凝剂 实验步骤： 1.洗涤红细胞 取静脉血2.0mL，放入含0.4mLACD抗凝剂的试管中，混匀。吸取0.2mL抗凝血放入试管中，加入4mL遇冷的生理盐水，轻轻摇匀。2500r/min离心5min，倾去上清，重复三次。 2.溶血液的制备 向红细胞沉淀中加入溶血剂0.2mL，震荡1min，4℃放置10min以上。 3.NADP的测定 取石英比色杯两只，标记为“测定”及“空白”，按表操作： 试剂 体积 蒸馏水（μL） 0.5mol/LTris-HCl MgCl2缓冲溶液（μL） 6mmol/LG6P-Na2(μL) 2040 300 300 2mmol/LNADP+（μL） 混合后放入带恒温水循环（25℃）的紫外线分光光度计中，预热10min 然后在“测定”中加入溶血剂60μL。“空白”中加入“溶血剂”60μL，混匀 300 以“空白”调“0”，1min后开始测定340nm吸光度（A304），每2min记录吸光度一次，至10min止，比较每2minA值变化情 况，若相近则表明酶促反应平稳。以10minA值的变化（△A340）计算NADPH的产量。 4.溶血液中血红蛋白含量测定 取一支，按下表操作： 试剂 体积 Drabkin试剂（mL） 溶血液（mL） 3.0 0.3 混匀，室温放置15min，以Drabkin试剂调零，读取540nm的吸光度（A540） 实验结果： 1.NADPH产量的计算 NADPH在340nm处，其每微摩尔的吸光系数为6.220，故10min内NADPH的产量计算公式为： NADPH产量（μmol）=△A340/6.22 2.血红蛋白含量的计算 血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以后，在540nm处， 其毫摩尔吸光系数为44，故溶血液中血红蛋白的含量公式为： 血红蛋白含量（mmol）=A540/44 3.G6PD比活性（U/g Hb）的计算 C6PD比活性单位（U/g Hb）=△A340/6.22×1/10×1/0.02×(44×100×10×1000)/A540×64500×11 =△A340/A540×49.85 参考范围：正常值：大于2.8U/g Hb 注意事项： 1.洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。 2.测定NADPH时读取吸光度时间要准确。 3. 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。 溶血性黄疸，又称为肝前性黄疸。属于高未结合型胆红素血症。此类黄疸是由于红细胞的大量破坏，在单核-吞噬细胞系统产生胆红素过多，超过了肝细胞摄取、转化和排泄胆