间充质干细胞调节破骨细胞发育和功能及研究.pdf

中文摘要 中文摘要 间充质干细胞调节破骨细胞发育与功能的研究 研究背景和目的 破骨细胞是一类起源于造血干细胞的成体细胞，它们大部分贴附于骨表面， 可以分泌多种酸和溶解酶来降解骨组织。在机体代谢稳定时，只有少量的破骨细 胞生成，与成骨细胞相协调，参加骨重塑。近来，研究人员发现破骨细胞还参与 机体防御与修复，炎性疾病以及肿瘤的骨转移。破骨细胞的发育很大程度上受到 其所在的细胞微环境的影响，其周围的细胞分泌多种重要细胞因子，表达细胞表 面分子来调节破骨细胞的生成。 stem 间充质干细胞(mesenchymalcells，MSCs)最早在骨髓中被发现，适宜的 条件下能分化为多种细胞。MSCs及其分化的细胞是骨髓微环境中的主要支持细 胞。MSCs借助细胞因子和／或细胞间直接接触，调节大多数造血细胞的存活、增 殖和分化。 虽然MSCs和破骨细胞都位于骨髓微环境中，然而，有关MSCs和破骨细胞 之间联系的研究却不多。本研究借助于一种可靠高效的小鼠MSCs分离培养方 necmsis 法，着重研究了MSCs受到肿瘤坏死因子伍(tumorfacto卜a，TNF．a)刺激 后，对破骨细胞的抑制作用及其机制。并借助类风湿关节炎病人的关节腔液 anhritis fluid，RASF)和脂多糖注射小鼠模型，探究了MSCs (rheumatoidsynovial 在体外和体内复杂炎性微环境中对破骨细胞的调节作用。同时，初步研究了RASF 来源的MSCs对破骨细胞的调节作用。 研究方法 l、采用骨实质分离培养法获得小鼠MSCs，对其进行三系诱导分化鉴定。以流 式分析其免疫表型。 2、分离小鼠cDllb+单核细胞，将其与MsCs共培养，部分培养组内再添加巨噬 factorM-CSF)和核因子1cB 细胞集落刺激因子(macrophagecolony·stimulating activatorofNF．1cB 的受体激活子配体(receptor ligand’RANKL)，观察MSCs 对于单核细胞来源的破骨细胞分化、成熟、存活和骨吸收能力的影响。 3、以TNF．a预处理MSCs，然后再用于和单核细胞共同培养。有些实验组中， 直接添加TNF．a到MSC和单核细胞的共培养体系中去。上述实验组同样应 用于象牙片共培养试验，检测破骨细胞的骨吸收能力。接下来，采用transwell V 中文摘要 培养法把MSCs和单核细胞共同培养但是避免直接接触，再进一步采用 RT-PCR，real．time PCR和ELISA来分析MSCs中破骨细胞生成抑制因子．骨 OPG在mRNA和分泌蛋白水平的变化。分析TNF．值刺激后，MSCs中破骨 mRNA表达情况。 ERK／MAPK和刷刈SAPK通路有无发生活化。采用这三条通路相应的通路抑 PCR检测MSCs 制剂来预处理MsCs，再给予TNF吨刺激，然后以reaJ-time 中oPG的mRNA水平。同时，采用通路抑制剂来预处理MSCs。再给予TNF．Q 刺激，然后以单核细胞共同培养，观察MAPK通路活化对于破骨细胞生成的 影响。 5、分别对n吓．仅刺激后的MSCs免疫学表型和多向分化能力做检测。同时，采 用CFSE标记法，观察TNF．a刺激过的MSCs能否抑制conA引起的CD3+T 淋巴细胞增殖。 样本刺激Mscs，再把MScs和单核细胞共同培养，观察破骨细胞生成的情 况。 7、经静脉给脂多糖小鼠注射MSCs，取小鼠股骨做病理切片，做原位抗酒石酸