抗神经导向因子netrin-1受体-UNC5B单克隆抗体制备和功能及研究.pdf

2 抗神经导向因子netrin-1 受体-UNC5B 单克隆抗体的制备和功能研究 中文摘要 抗神经导向因子netrin-1 受体-UNC5B 单克隆抗体 的制备和功能研究 中文摘要 研究背景： 神经系统作为一个神奇而复杂的组织，无论在其解剖结构还是生物学方面都存在 精细的调控环节。2013年美国政府宣布投入1亿美元用于大脑研究，试图解决迄今无 法解决的难题：为人类大脑行动路线做记录并制图，显示“百万大脑细胞是如何互动 的”。其重要研究内容就包括了：测量关于单个神经细胞是如何工作的，信息在神经 细胞之间是如何传递的，以及当产生记忆时神经细胞之间的联系是如何得到加强和减 弱的。而神经导向因子能够在神经元发育和信息传递过程中发挥调控作用，能够引导 神经细胞定向生长，为神经系统复杂网络结构和特异的传导功能提供解剖和生理基 础；因此，它成为大家研究的热点问题。神经导向因子netrin-1是最早发现的可溶性 神经导向因子，在许多物种的神经系统中都有高表达。在神经发育过程中，神经生长 因子netrin-1通过与结肠直肠癌缺失蛋白（deleted in colorectal cancer, DCC ）和UNC-5 同源蛋白(uncoordinated-5 homolog, UNC5H)两大受体家族结合发挥作用。其中， UNC5B （Uncoordinated-5 homolog B receptor ）与netrin-1结合在神经细胞发育中发挥 负向调控作用；这种作用与DCC受体参与的正向调控作用协调，共同促进生长锥生长 使轴突延长，引导其生长方向。近些年的研究还表明，netrin-1和UNC5B在很多肿瘤 中表达异常，可能在肿瘤的发生过程中扮演重要角色。为了进一步深入探讨UNC5B 在肿瘤中的表达及其相关功能，制备了UNC5B单克隆抗体。本研究选择性的选取 UNC5B基因胞外区的两个免疫球蛋白区域（Ig domain ）进行抗体制备。由于该区域 能够与配体netrin-1结合，通过激活下游信号发挥生物学功能。因此用该片段免疫小 鼠制备的单克隆抗体，不仅能够与UNC5B结合，还具有其他的生物学活性。 目 的： 本研究旨在应用单克隆抗体技术，制备能够识别UNC5B蛋白的单克隆抗体，用 以探讨UNC5B与肿瘤转移的关系。并在食管癌组织中探讨了UNC5B 的表达，为以后 I 中文摘要 抗神经导向因子netrin-1 受体-UNC5B 单克隆抗体的制备和功能研究 相关研究提供基础。 方 法： （1）首先体外扩增UNC5B 基因胞外端序列，将该序列插入带有 His 标签的原 核表达载体pET-32a 中进行原核表达。分析原核表达产物的可溶性，进行规模化表达。 （2 ）利用GE Healthcare 公司Glutathione Sepharose 4B 纯化说明书，纯化UNC5B 重组蛋白；利用Nano drop 测定蛋白浓度，SDS电泳考马斯亮蓝染色分析蛋白 纯度。 （3 ）经传统单克隆抗体技术，制备UNC5B 单克隆抗体；然后以商品化UNC5B 多抗为对照，用酶联免疫吸附试验（ELISA ）、蛋白印迹（Western Blot ）、免疫荧光 （Immunoflourescence ）和流式细胞（Flow Cytometry ）方法验证单克隆抗体与UNC5B 的特异性结合能力。 （4 ）细胞迁移能力分析：细胞划痕实验能够模拟体外细胞致伤愈合的修复过程， 根据培养基中添加UNC5B 单克隆抗体及其配体netrin-1 后细胞迁移长度的变化，分 析该化合物对细胞损伤愈合的影响；transwell 实验模拟体内细胞迁移的原理，根据上、 下小室营养成分趋化细胞迁移数量的不同，分析其对细胞迁移的影响。 （5 ）细胞增殖实验（CCK-8 assay）检测netrin-1 和UNC5B 单抗对肿瘤细胞增 殖能力的影响。 （6）