颗粒裂解肽抗菌结构域重组表达和生物学活性分析.pdf

洲II J III ITII I T IIIIIIl Y1 摘要 颗粒裂解肽G13结构域是具有伽螺旋结构的两亲型阳离子抗菌肽。本实验 即a．信号肽，并对信号肽进行改造，改变其可能出现的信号肽切割不完全情况， 再将改造后的a．信号肽克隆到pYES2质粒上，构建成具有分泌表达能力的 试验结果表明，表达后的重组G13结构域被直接分泌到胞外，并且初步鉴定分 泌表达的G13对E．coliDH5a具有抑菌活性，为后期简化分离纯化步骤和进一步 的抑菌活性研究奠定基础。 此外，利用自发光lux基因作为报告基因，检测颗粒裂解肽G13结构域对 SOS启动子控制下的报告基因表达的影响。研究表明重组G13结构域可诱导报 告基因的表达，且诱导表达的水平具时间效应，呈现峰型图，在处理的开始阶段 (4rain左右)lux基因被强烈诱导表达并且达到峰值，随后lux基因表达水平逐 渐平缓下降。试验结果表明，重组G13结构域引起细菌内SOS操纵子阻遏蛋白 LexA蛋白的降解，诱导发生SOS反应。 另外，本实验对与G13结构域具有67％序列结构相似度的NKLF-2结构域 BL21工程菌在诱导后，菌 的电洗脱纯化方法做了初步的研究。pACYC-NKLF2 有目的蛋白的凝胶块切下后，在恒流条件下将NKLF．2从凝胶电泳到透析袋中， 用PBS缓冲液透析，并用丙酮沉淀目的结构域，Tdcine，SDS．PAGE电泳检测。 结果显示，用电洗脱方法得到纯化的重组NKLF．2结构域，为后期运用质谱和园 二色谱的技术方法进行结构功能等方面的研究提供了另一种技术路线。 关键词：G13结构域，SOS反应，酿酒酵母，信号肽，分泌表达 ABSTRACT G13 of isall cationicantimicrobial fragmentgranulysin peptide amphiphilie whichhasa-helicalstructures．Inthis usedPCRto Gt-factorfrom study,we amplify the vector of transformed Saccharomycescerevisiae，and expressionpPICZ舡A a—factorto the conditions．Thetransformed旺一factorwas changeincompletecutting ‘ clonedintothe the andsecretionvector pYES2plasmid,thenpYES2-aexpression wasconstructed．InsertedG13domainintothe vectortoconstruct pYES2-a 3 inducedin cerevisiae plasmid，and SaccharomycesINVScl，then pYES2一a-Gl detectedTricine-SDSresults by electrophoresis．Thee