人巨细胞病毒UL128基因编码蛋白生物学功能及研究.pdf

一、摘要 中文 英文 二、英文 三、论文 前言 材料 结果 讨论 结论 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………37 五、参考文献…………………………………………………………………………38 六、附录 综述………………………………………………………………………………………………………一39 在学期间科研成绩………………………………………………………………47 致 射………………………………………………………………………………………………………．．48 个人简介…………………………………………………………………………49 ·中文论著摘要· 酵母双杂交筛选与人巨细胞病毒ULl28两种不同结构 相互作用蛋白 目 的 人巨细胞病毒 Human 在人群中感染率为50％．80％。正常人感染HCMV后表现为无症状的隐性或潜伏 感染。而一旦人体的免疫机能发生重大变化时 如妊娠、肿瘤、HIV感染、器官 移植和新生儿等 ，HCMV即从潜伏感染活化为继发性的增殖感染，引起严重的 临床症状甚至致死。同时HCMV感染还可引起间质性肺炎、肝炎、脑炎、视网膜、 肾、神经系统、肠胃系统的疾病。随着免疫低下人群患者的增多，HCIVIV感染及 其引发的严重疾病 致盲、致死 日益受到关注。 HCMV广泛的致病性是由其病毒感染多种类型细胞的能力决定的。在免疫功 能低下人群中HCMV感染的首要目标为内皮细胞和上皮细胞。研究证明HCMV ULl31A．128编码蛋白是病毒在内皮细胞中的复制及白细胞的播散过程中的重要 决定因子。而我们在研究中发现ULl28 flame 具有两个大 ORF openingreading ULl28-519bp和 小不同的片段，分别为519bp和642bp，我们将其命名为HCMV HCMV ULl28．642bp，为了观察两个ORF片段所编码蛋白的功能是否相同及其是 否在HCMVULl31A．128编码蛋白感染内皮及上皮细胞过程中发挥着各自不同的 作用，故而利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与HCMV ULl28．519bp和HCMVULl28．642bp编码蛋白相互作用的蛋白，这将为研究 HCMV ULl28基因在内皮细胞感染嗜性中所发挥的作用及揭示HCMV先天感染 致病机理、解决人巨细胞病毒先天感染的防治、减少先天畸形儿出生等医学问题 奠定基础。 实验材料与方法 一、实验材料 标本为中国医科大学附属盛京医院病毒室保存的临床低传代分离株H；酵 fetusbrain librar由武汉大学生命科学学院 表达质粒pGBKT7及pACT2一Human 毒学国家重点实验室肖庚富教授惠赠：构建表达载体的相关试剂 Takara公司 ； Elmer 司 ；常用实验设备如BECKMAN台式低温高速离心机、PerkinPCR循环 仪、电穿孔仪 BioRad 、全温振荡培养箱等；常用数据库及分析软件如基因组 数据库、蛋白质分析数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件等。 二、实验方法 一 HCMV ULl28两种基因片段的构建及鉴定 技术将HCMV 为模板，从而扩增出ULl28基因的两个不同大小的片段。 2、将ULl28基因的两种片段分别切胶纯化后与载体pGBKT7同时进行双酶 pGBKT7．ULl28．642bp ，测序并分析。 二 酵母双杂交筛选 1、检测重组质粒对酵母的毒性和自激活活性； 2、采用醋酸锂法将酵母双杂交系统中的重组诱饵载体一重组质粒 养至菌落长出，以X—gal筛选蓝色的阳性克隆。 3、回转杂交鉴定：玻璃珠法提取酵母阳性质粒。转化到大肠杆菌中TGl中 进行PCR鉴定。提取质粒分别与HCMV ULl28．519bp和HCMV ULl28．642bp共 同转化酵母菌株AH 生长作为假阳性排除。 2 4、鉴定后的阳性克隆进行测序，经Genbank生物信息学软件进行BLAST分 析。本筛选过程重复进行三次。 结 果 一、HCMVULl28两种基因片段的构建及鉴定 l、采用特异性引物扩增出HCMV ULl28-642bp基因 ULl28—519bp和HCMV 片段，片段长度分别为519bp和642bp， ULl28的两个不同片段克隆到酵母系统的转录结合域 2、并成功将HCMV I 及SalI限制性内切酶进行酶切鉴定，测序分析显示结果与预期一致。 测序结 果表明融合区域的读码框正确并有正确的方向。经测序证实为HCMVULl28序列 且无碱基突变。 二、酵母双杂交 l、证实pGBKT7．ULl28两种质粒对酵母细胞无毒性及自激活效应 2、将HCMV ULl28—642bp 筛选从SD／．Ade／．His／．Leu／．Trp平板