生物化学蛋白质的共价结构.ppt

C-末端氨基酸鉴定——还原法 肽链C末端AA α-氨基醇 + 氨基酸 层析、HPLC、质谱等鉴定 水解 C-末端氨基酸鉴定——羧肽酶法 概念：一类肽链外切酶，专一地从肽链的羧基端开始逐个降解，释放出游离氨基酸，被释放氨基酸量对反应时间做动力学曲线，判断C端氨基酸序列。 方法：常用4种羧肽酶对多肽进行处理。例如，羧肽酶A能释放除Pro、Arg、Lys之外的C末端残基；羧肽酶B则只水解Arg、Lys为C末端的肽键。A+B则可以释放除Pro之外的任意C端aa残基；羧肽酶Y则可以作用于任何一个C末端残基。 当几条多肽链通过二硫键交联在一起时，用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白变性，暴露出分子内部的S-S键； 过甲酸氧化法和巯基化合物还原法打开二硫键 ； 用烷基化试剂，如碘乙酸，保护生成的巯基，以防止它重新被氧化； 酸水解 碱水解 1. 酸水解 常用6mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时； 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏； 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。 2、碱水解 一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时； 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高； 部分的水解产物发生消旋化； 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。 水解后的氨基酸组成分析 化学裂解法 溴化氰： Met-X 羟胺 NH2OH：Asn-Gly Edman测序可以连续降解几十个氨基酸，但是天然蛋白长度多在100个氨基酸残基以上，因此必须把蛋白分子用蛋白酶水解或者化学裂解成小的肽段。 A.溴化氰断裂：Met-X p129 断裂由甲硫氨酸残基（Met）的羧基参加形成的肽键。蛋白中甲硫氨酸含量少，所以可以产生不多的肽链。 B.羟胺断裂：Asn-Gly NH2OH在pH 9时能够专一性断裂Asn-Gly 之间的肽键，Asn-Leu和Asn-Ala之间的键也能断开。 2. 蛋白酶裂解法 概念：用于肽链裂解的蛋白水解酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶等。这些蛋白酶都是从肽链内部进行裂解，又称内肽酶。每种酶有不同的专一性酶切位点： N-端分析法（Edman降解） 能够不断重复循环，将N端氨基酸逐个标记和解离，已有机械化的蛋白质测序仪 B. 氨肽酶或羧肽酶法 从肽链的N-末端或者C-末端逐个向里切，绘制水解时间与释放氨基酸的量来确定肽链的氨基酸组成。但是局限性大，只适合检测末端几个氨基酸 C. 质谱 用样品量少，灵敏度高，速度快，是主流 苯异硫氰酸酯法 已自动化-氨基酸测序仪 水解、分离氨基酸 二硝基氟苯 二硝基苯基谷氨酸 还原二硫键 E（Glu）是氨基酸的N末端 用胰蛋白酶酶解、分离片段、Edman测序 用溴化氰裂解、分离片段、Edman测序 拼接序列 N 端 C端 含有38个氨基酸残基；如果用Trysin酶解，可产生4个肽段；用溴化氰裂解产生3个肽段。 T-2是N末端，因为其末端为Glu(E); T-3是C末端，因为其不以Arg(R)、Lys(K)结尾 C-3与T-1和T-4都重叠 用特异性低的蛋白酶，例如胃蛋白酶， 水解蛋白质成小片段的肽段 对角线电泳——样品点在滤纸中央 一向电泳 用过甲酸蒸气断裂二硫键 旋转90度，进行第二向电泳 茚三酮显色 常规肽段在对角线上 含硫磺基丙氨酸肽段偏离对角线 对含有硫磺基丙氨酸肽段进行序列分析 四、蛋白质的氨基酸序列与生物学功能 （一）同源蛋白质的物种差异与生物进化 （1）同源蛋白质：在不同生物中行使相同或相似生物学功能的蛋白质称同源蛋白质，例如血红蛋白。其氨基酸序列具有明显的相似性，即同源性。同源蛋白具有一个进化祖先。 （2）同源蛋白质的某些位置的氨基酸残基在已研究过的物种中都是相同的，这些氨基酸残基成为不变残基；其他在不同物种中变化大的则称为可变残基。 含有血红素的细胞色素c N 端 C 端 1 Gly 6 Gly 10 Phe 17 Cys 18 His 29 Gly 30 Pro 32 Leu 41 45 Gly 48 Tyr 38 Arg 34 Gly 52 Asn 68 Leu 59 Trp 70 80 Met 82 84 Gly 91 Arg 100 Gly 细胞色素c及其系统进化树： 对40多种物种中的细胞色素C氨基酸序列分析，其多肽链中28