毕业论文：农杆菌介导的水稻转化体系的优化.doc

摘要 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为约40%的人口提供了主要食粮。虫害是造成水稻减产减收的主要原因之一。水稻虫害种类繁多，我国每年因虫害造成的产量损失占到水稻总产量的 5% 以上，给水稻的生产带来了极大危害。目前，我国控制水稻虫害最主要的方法是使用化学杀虫剂，但化学防治带来一系列问题，如环境污染，生产成本提高和食用安全性降低等。因此，通过培育自身能够抵抗虫害的水稻品种来防治水稻虫害无疑是最经济安全的有效策略。从已有的研究来看，仅依靠常规育种难以解决抗虫种质资源稀缺的问题，因此，通过基因工程手段导入外源抗虫基因，进而培育抗虫转基因水稻越来越受到人们的重视。 近年来转Bt基因抗虫水稻已经在生产上得到了广泛的应用，随着抗虫转基因水稻的大规模种植，Bt基因抗虫谱相对狭窄及害虫易产生耐受性等问题相继引起了人们的关注。因此，从自然界中分离克隆出更多、更有效的基因成为解决这些问题的方法之一。 籼稻是亚洲栽培稻的重要亚种，全世界水稻栽培品种中有80%以上属于籼稻，其组织培养研究具有重要意义。而籼稻的组培特性普遍较差，再生率很低，导致一些生产上应用价值较大的优良品种转化仍然难以成功或转化频率低，因而研究优质籼稻的愈伤组织形成和植株再生能力对于遗传转化率提高十分必要。 农杆菌介导法因具有转化拷贝数低等独特的优势，而广泛应用于转基因抗虫水稻研究中。然而，水稻不同品种间遗传差异性比较大，且转化反应对水稻基因型依赖性强，从而增加了农杆菌介导的水稻遗传转化的复杂性和随机性。因此，通过对农杆菌介导的水稻转化体系的优化提高转化率十分必要。 本研究主要进行了以下方面的工作： 在新型Bt基因Cry30Fa1和Cry54Aa1序列的两端分别增加酶切位点序列，送基因合成公司合成，然后将目的基因片段与中间克隆载体pUPROK分别进行双酶切，连接，获得含目的基因的中间载体。测序鉴定得到序列正确的阳性载体，用内切酶切下目的基因片段并插pCDMAR-Hyg载体，最终获得高效表达双元载体pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg与pCDMAR-Cry54Aa1-Hyg，并通过酶切和测序的方法鉴定出上述载体的正确性。 通过对愈伤组织继代次数与继代培养基中加入抗坏血酸（Vc）浓度的优化，调整愈伤组织生长状态，提高胚性愈伤组织数量。结果表明R125与R818的愈伤组织继代2-3次，分化率最高；继代培养基中加入Vc浓度为40mg/L，能减少愈伤组织褐化率且对其分化能力无影响。 通过对洗菌后及分化前愈伤组织的干燥处理，改良农杆菌介导的水稻遗传转化体系。结果表明洗菌后进行干燥及分化前愈伤组织在滤纸上干燥2天，能够加快分化速度，提高分化率。 农杆菌介导法将外源基因Cry30Fa1与Cry54Aa1转入三系恢复系R125与R818中，通过PCR检测与潮霉素溶液检测转基因植株。结果表明Cry30Fa1与Cry54Aa1转R125未获得转基因阳性植株；Cry54Aa1转R818也未获得转基因阳性植株；Cry30Fa1转R818共获得233株转基因再生植株，经过潮霉素溶液检测和分子检测，其中46株为含目的基因的阳性植株。 关键词：籼稻；Cry30Fa1基因；Cry54Aa1基因；抗虫；农杆菌介导法 Abstract Rice is one of the most important grain crops in the world, for about 40% of the worlds population taking it as their staple food. However，insect damage is one of the main reasons to decrease the rice yield. There are a large variety of rice pests in China. The rice production loss is more than 5% of total yield because of insect damage. At present, the main method to control rice pest is to utilize chemical pesticides. However, it caused a lot of problems, such as environmental pollution, higher production cost, food safety, etc. Breeding new rice varieties that produce insecticidal proteins by themselves is undoubtedly the most economical and