抗体的制备及应用Final.ppt

抗原设计 抗原制备 抗体制备 原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12个氨基酸或碳水基团组成。为选择好的抗原决定簇，应符合以下三点：1．亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的；2．处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合；3．有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以很多蛋白质的决定簇处于N端或C端。 软件预测表位 分析氨基酸序列中是否存在信号肽 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 利用生物软件进行抗原表位预测 http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/ ? http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/ DNAstar（Protean）、DNASSIST 利用BLAST工具进行同源性有哪些信誉好的足球投注网站 生工为您免费完成多肽抗原设计 抗原设计 抗原制备 抗体制备 多肽抗原制备：多肽合成 蛋白抗原制备：原核或真核表达蛋白 多肽合成后须偶联到载体蛋白（KLH，BSA，OVA），才可 以获得高效的抗体。多肽与载体蛋白偶联的方式如下： N端氨基偶联到载体蛋白 C端羧基偶联到载体蛋白 Cys巯基偶联到载体蛋白 载体蛋白交联的基本原则 将载体蛋白加在远离抗体识别区域的一端 在序列中没有Cys的情况下在N或C端加上Cys为交联的首选方法。 获取目的基因 基因亚克隆至表达载体 转化细菌并诱导表达 纯化蛋白 SDS、Western blot分析 全基因合成 RT-PCR cDNA文库：生工拥有20,000条人类cDNA和5,000条小鼠cDNA。 生工案例 生工优势 专业的技术团队 免费cDNA文库 免费进行多肽及蛋白抗原的设计 成熟、稳定的蛋白表达技术平台 拥有齐全的克隆及表达菌株 拥有完备的、大规模化生产及纯化蛋白的仪器设备 抗原设计 抗原制备 抗体制备 Western blot 联系我们 抗体服务部销售： 电话：021 抗体服务部技术支持： 电话： 021E-mail：antibody@ 样品中不含靶蛋白或浓度过低 抗体效价低或者结合不充分 去污剂的使用浓度偏高 膜漂洗过度 转移失败 原因 对 策 换用其他组织提取总蛋白或者增加蛋白上样量 保证抗体的质量，调整抗体稀释倍数 适当降低去污剂的使用浓度（Tween 20：0.02%） 减少清洗时间或次数 重新转膜 问题二：没有信号或信号微弱 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体的浓度过高或温育时间过长 膜或者缓冲液污染 原因 对 策 试用不同的封闭液、延长封闭时间或提高温度 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应（可在洗脱缓冲液中加入Tween） 降低抗体的使用浓度，减少温浴时间 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 问题三：背景太高 * Western blot 成功要素 质优量足的蛋白样本 科学的对照 正确的抗体选择、保存以及使用 细致的实验操作 步步检测 生工项目 目标蛋白：GABAα receptor γ2 subunit 组织来源：大鼠海马神经元 direct method indirect method IHC (Immunohistochemistry) Immunofluorescence 免疫荧光技术与免疫酶技术的原理基本相同，只是用荧光素作为显色系统。使用荧光标记抗体，直接定位、定性检测组织或细胞蛋白表达情况。较免疫组化具有灵敏度高、操作简单的优点。缺点是染色组织片不能长期保存。 IHC步骤 1、切片（载玻片处理、保存） 2、PBS冲洗，5min*3次。 3、消除内源性过氧化物酶：滴加3%H2O2于切片组织表面， 37℃ 10min 4、PBS冲洗，5min*3次 5、柠檬酸修复：PH6.0的柠檬酸缓冲液（CB），PBS冲洗，5min*3次 6、打孔：擦干 、2%的triton室温放置1h 7、PBS冲洗，5min*3次 8、封闭：5%血清（BSA）于 37℃，40min。 9、擦片（不用清洗），画圈，加一抗（稀释倍数根据抗体性质而定）,4℃过夜 10、PBS冲洗，5min*3次 11、滴加第二抗体：PBS洗净后用滤纸擦干，滴加二抗体，37℃ 30min。 12、PBS冲洗，5min*3次 13、DAB显色：在显微镜下控制显色时间 14、梯度脱水：用75%、80%、90%、100%、100%的酒精脱水，每个梯度8min。 15、脱水后需要将片拿出放于玻片架上，用吹风机吹干，进行封片（甘