--生物制片的基本原理-.ppt

杀死：两层含义。一是把用于取材的动物处死；二是使用化学 药品，迅速地终结生物组织的生理活性。 固定：在杀死的基础上，把组织或细胞按生活的状态固定下来 ，使在以后的制片过程中不发生任何变化。 保存：将固定好的材料浸泡于保存液使其不发生变质。 第二节 固定和固定液 在于通过固定剂，在尽量短的时间内使生物细 胞或组织停止生命活动，借助化学药品的作用使其 保持原来的形状和结构，同时易于后步骤的染色。 固定有物理方法固定（干燥、高热、低温骤冷等）、化学方法固定（用化学试剂配制成固定液进行的固定）。 固定液的类型 单一固定液的种类、性质及其应用 酒精、甲醛、冰醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、碘、锇酸 混和固定液的种类、性质及其应用 Zenken氏液、 Bouin氏液、 Carnoy氏液等等 1、乙 醇 组织保存剂，制片时的固定剂。50%以上的乙醇都有固定作用，固定浓度以80-95%为好。 固定的特点：杀死快,渗透力强，可使材料变硬。用纯酒精固定时间不宜太长，否则会使材料发脆，但70%的酒精可较久的保存材料 具有固定、硬化、脱水等作用 无水酒精固定时穿透速度快，宜做糖原固定。但取材薄时才能固定好，也容易变脆，收缩 染色不如甲醛 渗透力差 3、醋 酸 醋酸又称乙酸，常在16.6℃以下凝成冰状固体故名冰醋 酸 。 用 1%--5%的醋酸作固定液，渗透力极强，对一般组织短时间内就可产生固定作用。 醋酸可沉淀核蛋白，所以对染色质或染色体的固定和染色都很好，但它不能固定类脂物。 醋酸可使细胞膨胀和防止收缩；同时由于它不能凝固细胞质中的蛋白质，组织不会硬化，因此可与引起组织收缩的液体相混合，起到相互平衡的作用。 4、苦味酸(三硝基苯酚） 苦味酸是极毒的黄色结晶，极易爆炸，常配成饱和水溶液贮存，它在水中的溶解度为0.9%--1.4%，亦可溶于酒精、氯仿等。 可沉淀一切蛋白质，对类脂物无作用，也不能固定碳水化合物。渗透速度较慢。固定后细胞收缩明显，收缩率达50%以上，但不使组织硬化。 苦味酸的固定时间不宜过 长，否则会影响苏木精等碱性染料的染色。 苦味酸固定组织的黄色，在以70%酒精脱水时加入少许碳酸锂饱和水溶液即可除去。 5、升汞（氯化汞） 是一种毒性很强的化合物，渗透力仅比醋酸弱。 几乎可沉淀所有蛋白质，升汞能充分固定细胞质和细胞核，并可增加对酸 性 染料的亲和力，升汞能使组织收缩，但硬化作用不强，多与冰醋酸、铬酸盐及甲醛混合使用。 升汞固定的材料中常存有沉 淀或结晶，因此固定后用 0.5%的碘酒（70%酒精洗涤，以提出升汞；然后再用70%酒精洗涤，将碘 去掉；最后还要用0.2%--0.5%硫代硫酸钠溶液洗涤，彻底去掉碘黄色。 6、重铬酸钾 为橙红色结晶，性毒，为一种强氧化剂，不能与酒精、甲醛混合。同时为一种强硬化剂,渗透力差，很少单独使用。 与醋酸混合后，pH在4.6时可以固定染色体，以及对细胞质和染色体产生网状沉淀作用。在未与醋酸混合pH大于5.2时，对类脂体具有良好的作用，可以固定高尔基体和线粒体，但此时对染色体不利，不能用作核的固定。 常用浓度1%-3%，它固定的材料，一般不收缩，有的反而稍膨胀，但经酒精处理后可继续收缩，固定后可充分用水洗涤。 性质：灰黄色结晶，强氧化剂，剧毒 优点：目前最好的固定剂之一，脂类物质唯一的固定剂 缺点：渗透力弱，组织固定不均匀，价格昂贵 *取材较小，固定后用过氧化氢漂洗 性质：三氧化铬的水溶液。三氧化铬是红棕色结晶体，易潮解 ，强氧化剂，配好后必须立即使用。 优点：可使蛋白质、核蛋白、核酸等产生良好的固定不溶解。 缺点：渗透力弱，容易使组织收缩且过度硬化。 1、FAA固定液(万能固定液) 配方：50%或70%酒精90ml + 福尔马林5ml + 冰醋 酸5ml。 此液可用于一般植物组织的固定，一般薄嫩的组织用50%酒精，厚硬的组织用70%酒精，醋酸穿透力强，可缩短固定时间，有利于固定质量。一般固定5--20小时，超过时间也无妨，固定的材料不用水洗，可直接从70%酒精开始脱水。 2.卡诺固定液(Carnoys) 无水乙醇3份+冰醋酸 1份 无水乙醇6份+氯仿3份+冰醋酸 1份 此液可固定细胞质和细胞核, 对于花粉母细胞、胚胎以 及染色体的固定均可收到良好的效果。 此液由于有较多醋酸，所以固定速度很快，不同的组织固定的时间也不相同，如根尖固定15分钟；花药固定1小时；动物组织因1.5-3小时，固定无需水洗，要用纯酒精浸洗数次。 3