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9 层析技术 CHROMATOGRAPHY 9.1层析的概念与分类 9.2吸附层析 9.3分配层析 9.4凝胶层析 9.5离子交换层析 9.6亲和层析 9.7气相色谱 9.8高效液相色谱 9.1层析的概念与分类 概念： 利用混合物中各组分在各种物理性质上的差异，使各组分以不同的程度分布在两相（固定相/流动相）中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离的目的。 8.6.1层析的概念与分类 分类： 按流动相的状态分类： 液相层析；气相层析 按固定相的使用方式分类： 柱层析；纸层析；薄层层析；薄膜层析 按分离原理分类： 吸附层析；分配层析；分子排阻层析/凝胶层析；离子交换层析；亲和层析 9.2吸附层析ABSORPTION CHROMATOGRAPHY 原理： 吸附剂的选择： 洗脱剂的选择 操作 原理： 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各种组分分离的技术 吸附剂： 能够将其他物质聚集在自己表面上的物质 吸附剂的选择 羟磷灰石（结晶磷酸钙，HA）： 吸附力高、稳定性好；主要用于纯化蛋白质、酶、核酸、病毒；对核酸具有很强的吸附性 氧化铝（酸性/碱性/中性）： 主要用于分离酸性物质、碱性物质或生物碱、挥发油、帖类、酯类、甾醇等非大分子的物质 硅胶（SiO2*xH2O）： 分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸等 活性炭： 非极性吸附剂，专一性不强，主要由于除杂和吸附有色物质 洗脱剂的选择 要求：纯度高、稳定性好、能够完全洗脱所分离的组分、黏度小、易于和所分离的物质分开 根据分离物质和吸附剂的性质选择 如蛋白质或核酸用HA吸附后，可以用PH大于6的盐缓冲溶液洗脱；甾体用硅胶吸附后可以用有机溶剂洗脱 操作 设备：层析柱、部分收集器、磁力搅拌机、恒流泵等 选择合适层析柱（1：10 ~1：40）和吸附剂（用量：30~100倍） 装柱： （方式、均匀、防止气泡、平衡） 上柱与洗脱： （上样体积1/2；洗脱速度要严格控制） 收集与检测： 9.3分配层析DISTRIBUTION CHROMATOGRAPHY 原理： 分配系数：K =固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度 两种组分在同一两相体系中K值差别越大，在两相中的分配次数越多，越容易被彻底分开 纸层析 纸层析 Rf = 溶质斑点中心的移动距离/溶剂前沿的移动距离 影响Rf值的因素： 物质的结构与极性、滤纸的质量、展层剂的性质与比例、PH、温度、展开方式、样品纯度 操作方法： 样品准备、点样、平衡、展开、显色、结果分析 9.4凝胶层析 凝胶层析 gel chromatography 凝胶过滤 gel filtration 分子筛层析 molecular-sieve chromatography 分子排阻层析 molecular exclusion chromatography 凝胶渗透色谱 gel permeation chromatography （1）基本原理 分子筛/分子排阻 Kd = Ve – Vo/Vi Ve = Vo + Vi*Kd lg M = a－b Ve （2）分配系数Kd Ve = Vo + Vi*Kav Kav值的不同情况： Kav = 0 Kav = 1 0 ＜ Kav＜ 1 Kav ＞1 （3）洗脱图谱和分辨率 洗脱图谱：蜂高、蜂宽、蜂面积 分辨率? or (Rs) = 2（V2 – V1）/ （W1+W2） 影响分辨率的因素： 凝胶粒度 洗脱液的流速 上样量 相对黏度 （4）凝胶介质 总体要求： 凝胶的物理特性 常用介质介绍 总体要求 反应性低，惰性好 不带电或少带电荷 颗粒大小和孔径均一 选择范围广 机械强度大（操作压高） 凝胶的物理特性 颗粒直径、工作范围（排阻极限）、吸水率、操作压等 常用介质 凝胶的种类很多，其共同特点是内部具有微细的多孔网状结构，其孔径的大小与被分离物质的相对分子质量大小有相应的关系。常用的凝胶列举如下 交联葡聚糖凝胶（Sephadex） 琼脂糖凝胶（Sepharose）/Superdex 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel ） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel ） 是一种人工合成凝胶，由丙烯酰胺(CH3CHCONH2)与甲叉双丙烯酰胺(CH3CHCONHCH2NHCOCHCH2)共聚而成。 商品名称为生物胶-P (Bio-Gel P) 聚丙烯酰胺凝胶是完全惰性的，适宜于各种蛋白质、核苷及核苷酸等的分离纯化。 缺点是遇强酸时酰胺键会水解 一般在pH2-11的范围内使用 Bio-Gel P有P-2、P-4、P-10、P-100等多种型号， P后面的数字越大，越适合于大分子的分离， 但溶胀时所需要的时间也越长， 并且颗粒的机械强度随型号的增大而降低。 交联葡聚糖凝胶（Sepha