CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书.docx

CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书 目录 内容和保存 介绍 产品信息 方法 实验轮廓 设计单链DNA寡核苷酸 产生双链寡核苷酸 连接反应 转化感受态E.coli细胞 分析转化子 转染哺乳细胞系 附录A CRISPR核酸酶载体试剂盒的图谱和特点 附属产品 技术支持 参考 附录B CRISPR核酸酶表达细胞的富集 内容和含量 1.1 双链（ds）对照寡核苷酸序列 ds 克隆对照的寡核苷酸的序列如下所列。ds 克隆对照的寡核苷酸来自退火的，并在试剂盒中提供的50μM的双链寡核苷酸。 ds 克隆对照的寡核苷酸在应用于连接反应之前需要进行再退火和稀释。 5’ CATTTCTCAGTGCTATAGAGTTTT 3’ 3’GTGGCGTAAAGAGTCACGATATCT 5’ 1.2感受态细胞 转化效率≥1×109 cfu/微克质粒DNA 1.3 TOP10细胞的基因型 F-MCRAΔ（MRR-hsdRMS-mcrBC）φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1 araD139Δ（ARA-LEU）7697Galu galKpsL（STRR）endA1 nupG 2 介绍 2.1 产品信息 2.1.1 介绍 GENEART?CRISPR核酸载体试剂盒便于产生表达CRISPR RNA和tracrRNA的非编码RNA以及在哺乳动物细胞中Cas9核酸酶介导的靶基因的裂解或基因编辑的结构体。该Cas9核酸酶是基于从细菌化脓性链球菌II型CRISPR/ Cas系统，并经过精心设计的基因组编辑在哺乳动物系统（Jinek等人，2012;。Mali1等人，2013;。cong等人，2013） 。带有OFP的GENEART?CRISPR核酸载体允许Cas9和CRISPR RNA的基于流式细胞仪表达的细胞群的分选，而带有CD4的GENEART?CRISPR核酸载体使Cas9与CRISPR RNA为基础的表达细胞的富集。线性GENEART?CRISPR核酸载体提供快速和有效的方式来克隆编码所需CRISPR RNA靶到表达盒，允许Cas9核酸序列中的特定的方式靶向的双链寡核苷酸。虽然该工具包被设计来表达Cas9和引导RNA的代表以最简单，最直接的方式，使用该试剂盒的基因组编辑和靶位点的特定靶序列裂解分析假设用户熟悉的CRISPR系统，载体的原则为基础的生产CRISPR RNA，并转染哺乳动物系统。我们强烈建议用户拥有CRISPR系统的工作知识。 2.1.2该CRISPR系统 在CRISPR系统是一种使用RNA指导的DNA核酸酶沉默病毒核酸（Jinek等人，2012）原核适应性免疫系统。在细菌中CRISPR位点组成的串联重复序列由外源DNA片段的分离（?30bp的长度），称为间隔件。的重复间隔件阵列被转录为一个长的前体和重复序列内被处理，以产生用于指定由CRISPR核酸酶裂解的靶序列（也被称为protospacers）小crRNAs。 CRISPR间隔物，然后用于识别和沉默的RNA或DNA水平的外源遗传元件。必不可少的裂解是一个序列基序紧接在目标区的3端，被称为protospacer相邻的基序（PAM）的下游。在PAM中存在的靶DNA，但不能靶向它的crRNA。 2.1.3基因组编辑 基因组编辑包括使用在与内源性修复机制一起使用的设计好的核酸，以从基因组DNA中的特定位置中插入，删除或取代DNA序列。设计好的核酸酶在基因组中的特定位置诱导双链断裂（DSB），在这之后的内源性修复机制通过非同源末端连接（NHEJ）或同源性定向修复修复断裂。 II型CRISPR系统已被证明可作为在各种生物体，包括哺乳动物细胞的基因的编辑工具。 （Mali1等人，2013;cong等人，2013）。 它由三部分组成：CRISPR相关Cas9核酸（双链DNA的核酸内切酶），靶互补CRISPR RNA（crRNA），和一个辅助反式激活crRNA（tracrRNA）。该crRNA和tracrRNA作为一个短导的RNA为目标的Cas9核酸酶对特定基因组位点（图1）。 图1 CRISPR/Cas9介导的靶DNA裂解示意图 该crRNA和GENEART?CRISPR核酸载体的tracrRNA可以表示在一起为指导RNA，模仿在细菌系统自然crRNA-tracrRNA杂交。引导RNA的表达是由U6 polIII启动型的启动子（图2）驱动。 在GENEART?CRISPR核酸载体图2指南的RNA表达盒。 该系统具有通用性，且易于使用，改变目标专一只需要变更CRISPR RNA的设计即可。 3 方法 3.1 实验轮廓 下表和图列出了创建你的GENEART?CRISPR核酸酶载体和表达它的细胞所需的步骤。 步骤操作1设计的单链DNA寡核苷酸。 2退火单链寡核苷酸，以产生一个双