ELISA的原理技术及其在药物分析领域的应用.ppt

2.2.8 Cell-based ELISA的优势 2.2.9 CREB / pCREB Transcription Factor Assay基于ELISA技术的高通量方法 CatchPoint cAMP Assay Kit检测小鼠脑海马组织匀浆液中cAMP含量变化的实例 1.微量（痕量）小分子药物测定 1.1毒品及药物滥用控制 近年来，药物滥用问题在世界范围内日趋严重。随着毒品及药物滥用现象的蔓延，对成瘾患者监控方法的研究已经成为我国乃至全球的重要课题之一。 吗啡是典型的半抗原，因此可以制备抗吗啡抗体用于ELISA检测，能快速准确地检出血液样本中微量（痕量）的吗啡，可以有效鉴别、监控成瘾者。由于各国法律的差异，许多国家吸毒被界定为有罪，因此对于吗啡检测方法的可靠性提出了很高的要求。吗啡的ELISA检测方法在许多国家已经得到了法医界的认可，成为普遍使用的方法。 1.2 生物样本中微量抗生素的检测 1.2.2 氯霉素类药物检测 1.2.3 硝基呋喃类药物检测 1.2.4 磺胺类药物的检测 1.3 激素类药物检测 1.4 β-七叶皂苷钠血浆药物浓度测定 2. 蛋白及多肽类药物检测 感谢！ 3.4 　洗涤液 　　在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。 　ELISA的试剂准备B 3.2 　结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 1 酶的催化活性 2抗体（或抗原）的免疫活性 3含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4结合物尚要有良好的稳定性。 3.2.1 　结合物用的抗原和抗体 （一般性了解） 制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。 3.2.2　酶 （一般性了解） 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。 在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。 3.2.3 　结合物的制备 （一般性了解） 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 （1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-70%）和重复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。 （2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成chiff氏碱而结合。简便有效. 3.2.4　结合物（酶标记物）的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。 切忌反复冻融！ 3.2.5 　结合物（酶标记物）的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。 试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。 试剂准备 C 酶的底物 3.3 　酶的底物 （一般性了解） 3.3.1 　HRP的底物 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2为供氧体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 E TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2 、小分子醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea perox