RNA提取定量与RT-PCR.ppt

PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增或拖尾 假阳性 问题1：无扩增产物 无扩增产物之模板原因 无扩增产物之引物原因 无扩增产物之PCR条件原因 问题3：假阳性 ① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒 55℃ 30 秒 30 循环 72℃ 30 秒 ③ 72℃ 5 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时30分钟 PCR参数设置 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性30s， 60℃退火30s， 72 ℃延伸45s。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（30s） 55 ℃退火（30s） 72 ℃延伸（30s） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 本实验所扩增的产物DNA片段长度400bp～500bp, 可取5?l PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准DNA marker评估扩增的特异性。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 琼脂糖凝胶电泳原理 影响迁移速率因素 1、 DNA的分子大小 2、 琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象 4、 电源电压 5、 嵌入染料的存在 6、 离子强度影响 琼脂糖凝胶电泳原理 有效分离范围 实验材料 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 染料：Gelview、EB 电泳缓冲液：TBE 琼脂糖 DNA Marker 5000 溴化乙锭(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性. Gelview: 是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高, 且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光. 常用染料 实验材料 含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测目的基因片段大小。 应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。 DNA Marker 实验材料 凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 拔梳子 上样 电泳 取出凝胶 拍照 实验步骤 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使制板变形 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔 电泳前，确认样品孔位于电场负极； 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 Gelview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 紫外线照射不要太久 注意事项 现象：正对照有条带，而样品则无 M 样品A 样品B 正对照 纯度：含有抑制物 浓度：含量低 质量：全长 结构：二级结构 原因 对 策 纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板DNA 加大模板的用量 用好的反转录酶 用温度高的反转录酶 引物错误 引物设计不好 引物降解 引物合成、纯化不好 原因 对 策 合成前检查 评价、重新设计引物 换一管新引物 免费重新合成 退火温度 延伸时间 循环次数 原因 对 策 递度PCR 聚合酶的延伸速度 适当增加循环数 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 问题2：非特异性扩增 M 1 2 /sfzx/ 总RNA的提取、定量与RT-PCR 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学示范中心 Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程 目 的 实验流程 提取原理 操作步骤 逆转录原理