三HPLC分析方法的建立.ppt

第三讲.HPLC分析方法的建立 一. RPC分析方法建立 二. NPC分析方法建立 三. GPC分析方法 四. HPLC应用实例 五. HPLC的定量分析 一.反相HPLC（RPC） 分析方法的建立 样品的制备 溶剂萃取 固相萃取 膜分离，超滤， 超临界萃取等 图1非离子样品的反相分离过程示意图 黑点表示在极性流动相和非极性固定相间分配的样品分子 影响RPC的保留的因素： 1.流动相的影响： 水甲醇乙腈乙醇四氢呋喃丙醇二氯甲烷 A+B： 水+有机溶剂 最佳分离条件：1k 10 2.%B的选择： 3.流动相强度： 4.色谱柱和柱温的影响： 非极性、非离子化合物的RPC保留值规则： (弱）未键合硅胶≤氰基C1（TMS）C3C4苯基C8≈C18（强） 通常柱温增加1℃，K会减少1%-2% 反相色谱的选择性： 溶剂强度的选择性 溶剂类型的选择性 柱类型对选择性的影响 温度对选择性的影响 1.溶剂强度的选择性 2.溶剂类型的选择性 3.柱类型对选择性的影响 4.温度对选择 性的影响： 反相色谱中分析方法的建立： 反相方法建立的推荐步骤： 1.调整%B，使0.5k20，（1k10更好） 2.检查峰拖尾或塔板数低的现象 3.如果必要，调整选择性 a.微调%B b.改变有机溶剂 c.混合有机溶剂 d.改变柱类型 e.改变温度 4.优化柱条件（柱长、颗粒尺寸、流速） 混合溶剂的使用： 柱类型的影响： 不同溶剂与柱类型的结合使用： 正相色谱分析方法的建立 正相色谱保留机理 正相分析方法建立的推荐方法： 1.调整%B，使0.5K20，（氰基柱、己烷-丙醇做流动相） 2.检查峰拖尾现象 3.如必要，调整选择性 a.微调%B b.改变有机溶剂种类（MC、MTBE、EtAc） ；微调%B c.混合有机溶剂 d.改变柱类型（二醇、氨基、硅胶）；微调%B 4.优化色谱柱条件（柱长、颗粒大小、流速） NPC 溶剂选择性实验的对应色谱图 15×0.46 cm硅胶柱，流动相如前，2.0ml/min，35 0C。 样品为取代 萘 混合物，取代基：1 2-OCH3 ，2 1-NO2，3 1，2-（OCH3）2， 4 1，5-（NO2）2；5 1-CHO，8 2-CHO，9 1-CH2CN，10 1-OH，11 1-COCH3，12 2-COCH3，13 2-OH。 GPC分析方法 SEC保留机理 GFC:凝胶过滤色谱 水相流动相 分离水溶性大分子 固定相：多糖型凝胶、多孔交联聚甲基丙稀酸酯类 树脂、交联聚乙稀基醇树脂、羟基化聚醚类亲水性 树脂等。 GPC:凝胶渗透色谱 有机相流动相 分离脂溶性高分子 固定相填料：苯乙烯-二乙烯苯多孔微球系列 理想SEC填料的性能要求 SEC填料的色谱特征： SEC应用： 分离复杂样品，然后再以高分辨率的HPLC分离纯化. 分析纯化高分子化合物，以确定单聚、二聚和多聚物. 以校正曲线估算大分子物质分子量. 实例: 凝胶渗透色谱法测定羟乙基淀粉分子量 色谱条件: 1. 色谱仪器：pharmacia LKB HPLC pump 2248 KNAUER Differental-referactometer 2. 色谱柱：Shodex OHpak SB-804 HQ(聚羟甲基丙烯酸酯凝胶) 规格：  柱名 ??????????排阻限(Pullulan)??????粒径(μm)???????尺寸(mm)  SB-804?HQ????????1,000,000????????????10???????????8.0?x?300 3. 流动相：0.7%硫酸钠+0.02%叠氮化钠 4. 流 速：0.5ml/min 5. 柱 温：35℃ 实验步骤： 1. 选用分子量为2000000和180的两种淀粉确定该色谱柱的检测窗口,见图一。 3.标定曲线的确定 4.未知淀粉谱图 y = -2.692x + 5.6637 R2 = 0.9989 X=(VR-VR1)/ (VR0-VR1) tR1:19.673min tR0:12.902min tR1:14.530 计算得：未知淀粉 M=29046 银杏内酯 色谱条件： 色谱柱：Baseline C18 4.6×150mm,5μm 流动相：甲醇：水：四氢呋喃=25：65：10 流 速：1ml/min 检 测：ELSD, 蒸发管温度85℃，气体流速4.0Bar 五种二