专题课题多聚酶链式反应扩增DNA片段(上课课件).ppt

四、 课题延伸 例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点 五、实验小结 PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 模板 互补 Taq聚合酶 四种脱氧核苷酸 引物 变性、复性和延伸 72℃ * 专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应 扩增DNA片断 ㈠.DNA分子的结构 C、H、O、N、P 1.元素组成： 脱氧核苷酸 2.基本单位: 一.基础知识 脱氧核苷酸 脱氧核苷 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。 3.多脱氧核苷酸链得形成 多脱氧核苷酸链结构简图 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5’ 3’ 3’ 5’ 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 多脱氧核苷酸链结构简图 4.DNA分子的双螺旋结构 ⑴.DNA分子是由 的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。 ⑵. 与 交替连结，排列在外侧，构成基本骨架； 排列在链的内侧。 ⑶.两条链上的碱基通过 连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与 配对， 一定同胞嘧啶配对。 双螺旋 两条反向平行 脱氧核糖 磷酸 碱基 氢键 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 ㈡.DNA的复制 2.时期 有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。 3.场所 细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。 1.概念 由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。 4.基本条件 酶:解旋酶、DNA聚合酶 能量:ATP 原料:四种脱氧核苷酸 模板:DNA的两条链 ⑴.边解旋边复制(过程） 5.复制特点 ⑵.半保留复制（结果） 6.遵循原则： 碱基互补配对原则 7.精确复制的原因 8.复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性 ⑴规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 ⑵碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 总结：胞内DNA复制的基本体系 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 （三） PCR(多聚酶链式反应） 1、 DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物. 2、 DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸. 3、 PCR原理 ①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 ③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。 4、 Taq DNA聚合酶的应用 5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 ① P