产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定-定稿.doc

产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定 摘要：试验中的真菌一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。包括ACCC 31726、ACCC 32491、ACCC 32567、ACCC 32568等共计29株菌对其进行了微生物纯化、分离、筛选、酶活的测定及复核鉴定等。 关键词：纤维素酶活 筛选 真菌 ITS 鉴定 纤维素是自然界存在量最大的一类天然资源，且可无限再生。麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。并且我国每年产秸秆约7亿多吨，实现秸秆资源高效利用，是我国可持续发展面临的重要问题。能源危机和环境危机是整个人类社会目前面临的严峻问题，而合理有效的处理和利用纤维素资源将为解决这些问题提供一种有效的手段。 本实验通过对菌种产纤维素酶活的测定确定其酶活高低，并综合形态观察和ITS序列分析对其进行鉴定。 1.材料与方法 1.1试验材料 1.1.1 试验菌种一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。包括ACCC 31726、ACCC 32491、ACCC 32567、ACCC 32568等共计29株菌，所有菌种均来源于中国农业微生物菌种中心（ACCC）。 1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基 马铃薯 200.0g 葡萄糖 20.0g 琼脂 15.0~20.0g 蒸馏水 1000.0mL pH 自然 马铃薯去皮，切成块煮沸30.0min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000.0mL 羧甲基纤维素培养基（ CMCNa） NH4NO3 1.0g KH2PO4 1.0g KCl 0.5g Mn SO4 0.004g ZnCl2 0.0017g CoCl2 0.002g MgSO4?7H2O 0.5g FeSO4 0.01g CMCNa 10g 琼脂20g 蒸馏水 1000ml pH 6.5 羧甲基纤维素液体培养基（同羧甲基纤维素固体培养基配方，不加琼脂） 液体发酵培养基 玉米秸秆粉（40目） 10.0g 麸皮 2.5g KH2PO4 1.5g (NH4)2SO4 1.3g K2HPO4·3H20 2.9g CaCl2 0.15g MgCl2 1.0g FeSO4 0.005g MnSO4 0.0061g NaCl 1.0g 蒸馏水 1000 mL 1.1.3主要试剂 1.0%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：2g羧甲基纤维素钠（粘度300~600里泊）溶于200.0mL蒸馏水中，水浴加热至溶解，用一层纱布过滤，取滤液100.0mL加pH4.8的醋酸盐缓冲液20.0mL，再加蒸馏水410.0mL，贮冰箱备用。一周后应重新配制。 3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)制备：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和2.0mol/L NaOH溶液262.0 mL，加到500.0mL含有185.0g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5.0g结晶酚和5.0g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后用蒸馏水定容至1000.0mL，贮于棕色瓶中，半个月后使用。 pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8mL冰醋酸定容至100.0mL，称取27.2g的醋酸钠溶解并定容至100.0mL，将上述两种溶液等体积混合。 1%水杨苷溶液：1g的水杨苷溶液加少许pH6的缓冲液,，再用pH6的缓冲液定容至100mL。 1 mg/mL刚果红、水杨苷、whatman NO.1试纸、1 mg/mL 的葡萄糖标准液、羟基纤维素钠、葡萄糖、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、无水乙醇 （预冷）、70%乙醇（预冷）、氯仿异戊醇（24:1）、液氮、CTAB缓冲液、ITS1、ITS5、Buffer、Taq酶、dNTP、TE缓冲液、DNA电泳胶（0.8g，100ml，5%TBE）、PCR电泳胶（1.0g，100ml，1%TBE）。 1.2 实验方法 1.2.1菌种的初筛 采用的刚果红染色法对菌株的酶活力进行初步筛选。 实验原理：刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物便没法形成，培养基中会出现以