人类RNA的提取RT-PCR技术以及琼脂糖凝胶电泳.ppt

* 模板来自于 * 模板来自于 * RNA与琼脂糖凝胶电泳的那些事儿 作者：临床医学1303班5组第2小组 catalogue part 1：人类细胞质RNA的提取 part 2：RT-PCR的原理和方法 part 3：琼脂糖凝胶电泳结果的分析及其应用 part 1 人类细胞质RNA的提取 原理 步骤（以Trizol试剂为例） 一、原理 RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。 二、步骤（以Trizol试剂为例） Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。 准备工作 取材 组织样品的处理 氯仿抽提 异丙醇沉淀RNA 酒精洗涤RNA RNA溶解 NAME 1．准备工作 提取RNA前先打开冷冻离心机预冷，制好冰，用70%的酒精擦拭加样枪、离心管架和桌面，一次性手套，研钵，DEPC处理的tip、EP管等。 2．取材 取新鲜动物组织，立即置于冻存管投入液氮中速冻，在液氮中可保存一年左右，-80℃可保存三个月。 3．组织样品的处理 研磨法：戴好厚手套和口罩，取约0.1~0.2g冻存组织，于液氮充分预冷的研钵中用力研磨，期间不断加入液氮，充分研碎组织，小心别把组织洒到外面。将组织粉末用小勺移入1.5mL的EP管中，立即加入1mL Trizol（或预先加入），剧烈摇匀15s，室温静置5min。组织或细胞可适当延长在Trizol中裂解的时间，能获得较多的RNA。 匀浆法：取新鲜动物组织（或冷冻组织）0.1～0.2g迅速倒入匀浆器中，加入1mL预冷的Trizol，在冰浴中迅速匀浆20~30s然后将细胞悬液吸入另一EP管，室温静置5min。 细胞样品处理：贴壁细胞，完全除去培养液后直接向培养皿中加入1mL Trizol反复吹打几次，转入EP管，静置5min。 样本在Trizol中，-20℃至少可保存3天，-80℃可长久保存。 NAME 4．氯仿抽提 加入400μL氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min，4℃，12000r/min离心15min，RNA分布于水相中。将上层无色水相转移到另一Ep管中，防止吸到中间层蛋白。若抽提不彻底，可加200μL氯仿重复抽提一次。 5．异丙醇沉淀RNA 加入800μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min（细胞RNA -20℃静置20min），4℃，12000r/min离心10min，即可观察到管底的RNA沉淀，小心倾去上清液，将EP管倒扣在RNase Free的吸水纸上2~3min除去残留的异丙醇。 6．酒精洗涤RNA 加入0.7mL无水乙醇+200μL DEPC水洗涤RNA沉淀物，4℃，8000r/min离心5min，弃上清液，将EP管倒扣在RNase Free的吸水纸上室温干燥3~5min。 7．RNA溶解 向干燥过的沉淀物中加入20μL DEPC处理水（RNase Free水）50℃溶解10min，于-80℃保存备用。 溶解后的RNA容易被RNase降解，应尽量低温保存。为了防止痕量的RNase污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏等）中分离得到的RNA应贮存在甲醛中，以保存高质量的RNA。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中保存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA在水中保存三年仍保持稳定。 part 2 RT-PCR 原理 方法 PCR定义：PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA 的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。反应分三步： A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5 3方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 简介 RT-PCR 为反转录PCR(reverse transcription PCR)的缩写。