仪器分析第四章高效液相色谱.ppt

高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 高效液相色谱 一 概述 二 液相色谱仪 三 HPLC 检测器 四 各种色谱方法 五 HPLC分离利用 概述 － 特点 GC与HPLC比较 概述 - 分类 (1) 分配色谱 (2) 吸附或液固色谱 (3) 离子色谱 (4) 凝胶色谱或尺寸排阻色谱 各种色谱方法 （一）分配色谱 （二）吸附色谱 （三）离子交换色谱法 （四）排阻色谱法 （一）分配色谱 分配色谱 分配色谱 – 分离原理 分配色谱- 固定相 R --- 极性基团 疏水基团 固定相的化学构造 非键合相表面 键合相表面 ODC C18 C8 C1 Phenyl -NH2 -CN （二）吸附色谱 分离原理 （四）排阻色谱法 大分子不能进入多孔中，不被保留，随 Vm流出 中分子部分进入多孔中，一般保留 小分子完全进入多孔中，长时间保留。 （四）排阻色谱法 高分子化合物分子量及分子量分布 DNA碎片不同碱基支链分离。 HPLC应用概图 液相色谱仪 流动液贮存提供脱气 输液泵 进样系统 分离系统 检测系统 控制与记录系统 液相色谱仪 液相色谱仪 液相色谱仪 HP1100高效液相色谱仪 主要技术指标: 四元高压输液泵 流速0.2- 10.0mL/min 二极管阵列检测器，波长190-800nm应用范围：各种分子分离(M2000) 生产厂家：美国Agilent公司 凝胶渗透色谱仪 凝胶渗透色谱仪 主要技术指标：????????流速1mL/min，四氢呋喃溶剂系统　 示差折光检测器????????U/V-VIS检测器，波长190-700nm????????聚苯乙烯标样 应用范围：测定可溶于THF的高分子的相对分子量,相对分子量范围：1000--60万 生产厂家： 美国Waters公司 液相色谱质谱联用仪 1. 流动相贮存与脱气 （1）真空泵抽滤系统 （2）低溶性惰性气体导入替换 （3）超声脱气 2. 输液系统 活塞泵 注射泵 气动泵 注射泵 3. 进样系统 不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀 样 品 环 5. HPLC 检测器 溶液：折光，介电常数，密度 溶质：吸光光度，荧光光度，扩散电流等 （1）. 吸光检测器 （2）.荧光检测器 （3）.折光检测器 （4）.电化学检测器 （5）. 蒸发光散射检测器 （6）. 质谱检测器 常用LC检测器 （1）吸光检测器 单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光片可以到254，280，313，334，365等。生化中用到很多。 多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光 (2) 荧光检测器 荧光强度与溶液浓度的关系： 荧光强度正比于吸收的光量与荧光量子产率F I f = F I a I f --- 荧光强度 Beer’s Law: Ia = I0 –It = I0(1-10-elc) I 0 _--- 入射光强度 ；I t ---透射光强度 elc≤0.05, e-2.3elc = 1 – 2.3 elc If = 2.3 F Io elc If = Kc （2）荧光检测器 灵敏度比吸光好，选择性亦较好，光源可以使高强度汞灯或氘灯，但并不是所有物质都有荧光，可通过柱前或柱后衍生法来检测。 （3） 示差折光检测器 优点：通用性好，不受流速影响 缺点： 折光率测定受温度影响很大 不能用于梯度淋洗 灵敏度有限 应用：制备色谱中常用 HPLC分离应用 标准样品法 谱库 HPLC-FTIR HPLC-MS HPLC测定鸡蛋和猪肉中的磺胺类药物 脱气方法 4、色谱柱 名称 使用量 商品化 灵敏度 价格 吸光度 71% Yes 100pg-1ng 1 荧光 13% Yes 1-10pg 2-20 电化学 4.3% Yes 10pg-1ng 1-2 折光 5.4% Yes