细胞转染技术原理和应用.docVIP

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表： 转染方法 原理 应用 特点 磷酸钙法 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染瞬时性转染 不适用于原代细胞操作简便但重复性差有些细胞不适用 DEAE-右旋糖苷法 带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时性转染 相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用转染时需除血清 电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入 稳定转染瞬时性转染所有细胞 适用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件 病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 稳定转染 可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等 逆转录病毒 特定宿主细胞 但携带基因不能太大细胞需处分裂期需考虑安全因素 腺病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 瞬时转染特定宿主细胞 可用于难转染的细胞需考虑安全因素 阳离子脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 稳定转染瞬时性转染所有细胞 适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大 Biolistic颗粒传递法 将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达 瞬时性转染 可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞 显微注射法 用显微操作将DNA直接注入靶细胞核 稳定转染瞬时性转染 转染细胞数有限多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞 （各种转染方法的比较） ???? 除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体