土壤酶测定方法.docVIP

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参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法 土壤蔗糖酶 3,5- 二硝基水杨酸比色法: 试剂的配制 3,5- 二硝基水杨酸溶液:称0.5g二硝基水杨酸,溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中,加30g的酒石酸钾钠,用水稀释至100ml.(不超过七天) pH5.5磷酸缓冲溶液:1/15M磷酸氢二钠(11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中)0.5ml加1/15M磷酸二氢钾(9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中)9.5ml即成。 8%蔗糖溶液。 甲苯。 标准葡萄糖溶液:将葡萄糖先在50—58℃条件下,真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中(5ml还原糖/ml),即成标准葡萄糖溶液。再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。 标准曲线绘制:取1ml不同浓度的工作液,并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色,比色后以光密度值为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 2、操作步骤 称5g风干土,置于50ml的三角瓶中,注入15ml8%蔗糖溶液,5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h。到时取出,迅速过滤。从中吸取滤液1ml,注入50ml容量瓶中,加3ml3,5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。 溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色,最后用蒸馏水稀释至50ml,并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差,每一土样需做无基质对照,整个实验需做无土对照。 无土对照:不加土样,其他操作与样品实验相同。无基质对照:以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同。 3,5- 二硝基水杨酸比色法: 1、试剂配制 1%淀粉。 甲苯。 pH5.6磷酸盐缓冲溶液:1/15M磷酸氢二钠(11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中)0.5ml加1/15M磷酸二氢钾(9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中)9.5ml即成。 3,5- 二硝基水杨酸溶液:称0.5g二硝基水杨酸,溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中,加30g的酒石酸钾钠,用水稀释至100ml.(不超过七天) 麦芽糖(C12H22O11.H2O)标准溶液:配制每毫升含0.02—2mg麦芽糖液为标准液。 标准曲线绘制:分别取不同浓度麦芽糖标准液1ml,移于50ml容量瓶中,加2ml 3,5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流下冷却。定容后在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 2、操作步骤 称5g风干土,置于50ml的三角瓶中,注入10ml 1%淀粉溶液,再加10ml pH5.6磷酸盐缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h。 培养结束后,将悬液迅速过滤。从中吸取滤液1ml,注入50ml容量瓶中,然后按绘制标准曲线的显色方法进行比色测定。 为了消除土壤中原有的蔗糖、麦芽糖引起的误差,每一土样需做无基质对照,整个实验需做无土对照。 无土对照:不加土样,其他操作与样品实验相同。无基质对照:以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同。 脲酶试剂:甲苯10%尿素:称取10g尿素,用水溶至100ml。 柠檬酸盐缓冲液(PH6.7):184柠檬酸和147.5氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000。 苯酚钠溶液(1.35mol/L):62.5苯酚溶于少量乙醇,加2甲醇和18.5丙酮,用乙醇稀释至100(A),存于冰箱中;27NaOH溶于100水(B)。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将溶液各20混合,用蒸馏水稀释至100。 次氯酸钠溶液:用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。 氮的标准溶液: 精确称取0.4717硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml含有0.1mg氮的标准液 标准曲线绘制:吸取配置好的氮溶液10ml,定容至100ml,即稀释了10倍,吸取1,3,5,7,9,11,13ml移至50ml容量瓶,加水至20ml,再加入4ml苯酚钠,仔细混合,加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。 向容量瓶中加入1ml甲苯(以能全部使土样湿润为度)并放置15分钟 ③ 之后加入10ml 10%尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液(PH6.7),并仔细混合 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中,培养24h 培养结束后,用热至38摄氏度水稀释至刻度,仔细摇荡,并将悬液用致密滤纸过滤

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